乙肝病毒X蛋白促進肝癌血管生成的作用及其分子機制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus，HBV)感染是導(dǎo)致肝炎肝硬化進而發(fā)展成肝癌的重要因素。乙肝病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein，HBx)具有反式激活作用，促進肝癌的發(fā)生發(fā)展。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)HBx可上調(diào)多種癌基因表達，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細胞周期調(diào)控、促進肝癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移以及代謝調(diào)控。腫瘤細胞的惡性增殖需要營養(yǎng)物質(zhì)的不斷供應(yīng)以滿足腫瘤細胞快速生長的需要。腫瘤細胞能夠通過促進血管生成為營養(yǎng)物質(zhì)

2、的運輸創(chuàng)造條件進而促進腫瘤發(fā)展。HBx蛋白對肝癌血管生成的作用未見報道。為了研究HBx蛋白對肝癌血管生成的作用，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，對HBx蛋白促進血管生成的作用進行了初步探討，研究結(jié)果如下:
　　第一部分: HBx促進肝癌細胞血管生成作用及分子機制研究
　　為了研究HBx對肝癌血管生的影響，我們利用血管生成網(wǎng)格實驗。在肝癌HepG2細胞中轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒實現(xiàn)HBx蛋白過表達，收集條件培養(yǎng)液。將HUVEC細胞培養(yǎng)于去生長因子的

3、基底膜基質(zhì)置中，利用條件培養(yǎng)液處理HUVEC細胞，HUVEC細胞分化為網(wǎng)格狀，其網(wǎng)格形成狀況可以反映血管生成情況。血管生成網(wǎng)格實驗結(jié)果顯示，條件培養(yǎng)液處理的HUVEC細胞形成網(wǎng)格狀，實驗證明HBx具有促進肝癌細胞血管生成的作用。
　　為了進一步闡明HBx促進血管生成的分子機制，我們查閱血管生成研究相關(guān)文獻，在數(shù)據(jù)庫中尋找參與腫瘤血管生成重要基因，確定8個參與血管生成的重要基因包括TGFBR2、CPEB2、MCP1、Sphk1、MA

4、SPIN、RANBP9、FGF2、VEGF，找到基因序列，并分別合成其引物。培養(yǎng)肝癌HepG2細胞，通過轉(zhuǎn)染攜帶HBx基因的質(zhì)粒實現(xiàn)HBx蛋白過表達，利用RT-PCR檢測不同基因mRNA表達量。研究發(fā)現(xiàn)，HBx蛋白可明顯上調(diào)鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase1，SphK1)的表達，并呈劑量依賴關(guān)系。文獻報道，SphK1可以將神經(jīng)鞘氨醇(sphingosine)催化形成鞘氨醇-1-磷酸(S1P)，S1P可以參與血管生成方面

5、的調(diào)節(jié)，在腫瘤發(fā)展過程中起重要作用。上述研究結(jié)果在LO2與HepG2細胞系中得到進一步證實，同時利用Western Blot實驗，在蛋白水平驗證了HBx具有上調(diào)SphK1的作用，并呈劑量依賴效應(yīng)。為了確定HBx對Sphk1的調(diào)節(jié)作用，我們合成HBx基因干擾片段，在HepG2-X穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中將HBx基因干擾，檢測SphK1表達量，結(jié)果顯示SphK1蛋白表達量隨干擾量升高而降低。上述結(jié)果提示，HBx促進肝癌細胞血管生成的作用可能與Sphk1

6、有關(guān)。
　　第二部分:HBx上調(diào)SphK1作用的分子機制研究
　　上述研究顯示，HBx蛋自在RNA水平與蛋白水平皆具有上調(diào)SphK1的作用。HBx蛋白作為反式激活因子，可以在調(diào)節(jié)基因啟動子水平發(fā)揮作用。為了進一步闡明HBx蛋白上調(diào)SphK1的分子機制，我們利用熒光素酶報告基因?qū)嶒炑芯縃Bx對Sphk1啟動子活性的調(diào)節(jié)作用。將SphK1的啟動子全長進行分子克隆。將載有啟動子全長的質(zhì)粒與HBx蛋白表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到肝癌HepG2細

7、胞中，檢測報告基因活性。熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，HBx蛋白對Sphk1啟動子具有上調(diào)作用。
　　綜上所述，血管生成網(wǎng)格實驗證明HBx蛋白能夠促進血管生成，在影響血管生成的TGFBR2、CPEB2、MCP1、Sphk1、MASPIN、RANBP9、FGF2、VEGF等8個重要基因中，HBx蛋白可以明顯上調(diào)SphK1，并在LO2與HepG2細胞系中得到進一步證實。熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治霭l(fā)現(xiàn)就HBx蛋白能夠發(fā)揮其反式激活作用對S