Neuropilin-1在肝癌中的表達(dá)及其單克隆抗體對(duì)肝癌生長(zhǎng)抑制作用的初步研究.pdf

1、背景和目的：
　　肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，男性與女性中肝癌診斷率分別為世界第五和第七，男性及女性肝癌相關(guān)死亡率在癌癥相關(guān)死亡中分別居第二和第六。肝細(xì)胞癌占所有肝癌的70％-85％，其診斷和治療取決于多方面因素——腫瘤的大小，范圍，全身和肝功能情況。早期確診的肝癌患者，才有可能接受肝臟切除或移植等治療。然而僅有10％-30％的肝細(xì)胞癌患者適合根治性治療，大多數(shù)肝細(xì)胞癌患者，確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，無(wú)法行根治性治療，且預(yù)后較差

2、。而傳統(tǒng)的介入治療、放化療存在抗腫瘤效果較差、副作用大等缺點(diǎn)。分子靶向治療有著良好的腫瘤靶向性，毒副作用也較低，為肝細(xì)胞癌治療提供了新的治療手段及研究方向;因此，尋找新的藥物靶標(biāo)，開發(fā)新的抗肝細(xì)胞癌藥物具有深遠(yuǎn)意義。Neuropilin-1(NRP-1)是Semaphorin3A、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及多種細(xì)胞因子的共受體，參與腫瘤血管新生，腫瘤細(xì)胞存活、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。它在多種腫瘤細(xì)胞及組織中高表達(dá)，并與多種腫瘤的惡性程度密

3、切相關(guān)，被認(rèn)為是一個(gè)很有前景的癌癥治療靶點(diǎn)。為了發(fā)展靶向NRP-1的藥物，我們實(shí)驗(yàn)室前期通過雜交瘤技術(shù)制備了一株靶向NRP-1的功能性單克隆抗體(NRP-1 mAb，A6)，本文主要研究NRP-1與肝細(xì)胞癌惡性程度的相關(guān)性及抗NRP-1抗體對(duì)抗腫瘤的活性。
　　方法：
　　首先通過PCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞Bel-7402，HepG2，SMMC-7721中mRNA表達(dá)量，然后通過流式細(xì)胞術(shù)、Western blotting觀察抗體與

4、肝癌細(xì)胞的結(jié)合能力及NRP-1的蛋白表達(dá)量;免疫熒光及細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)NRP-1 mAb的特異性及在細(xì)胞表面的定位;免疫組化觀察抗體在腫瘤組織中的定位及NRP-1在不同病理學(xué)分級(jí)腫瘤中表達(dá)情況的不同;細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)(MTT)和集落形成抑制試驗(yàn)檢測(cè)NRP-1 mAb對(duì)肝癌細(xì)胞株增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NRP-1 mAb對(duì)肝癌細(xì)胞株凋亡的影響;對(duì)荷瘤裸鼠進(jìn)行NRP-1 mAb治療，驗(yàn)證其活體內(nèi)抗腫瘤活性;并通過免疫組化觀察治療后腫瘤內(nèi)NRP

5、-1和VEGF的表達(dá)以及微血管密度的變化;131I標(biāo)記的NRP-1 mAb在荷瘤裸鼠中的顯像檢測(cè)NRP-1 mAb在腫瘤中的靶向性及特異性。
　　結(jié)果：
　　NRP-1在不同肝癌細(xì)胞株中表達(dá)量不同，抗體對(duì)肝癌細(xì)胞有較高的親和力。免疫熒光及細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗體定位在細(xì)胞表面，免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗體能夠特異性的定位在肝癌細(xì)胞上并與肝癌的病理學(xué)分級(jí)、臨床分期等具有正相關(guān)性。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、集落形成抑制試驗(yàn)表明NRP-1 m

6、Ab對(duì)肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)、集落形成都有一定的抑制作用。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗體可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NRP-1 mAb可以特異性定位于腫瘤位置，并可對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1.NRP-1在肝癌細(xì)胞及組織中高表達(dá)，并與腫瘤的病理學(xué)分級(jí)有關(guān)，與腫瘤惡性程度相關(guān)。NRP-1 mAb可與肝癌細(xì)胞及組織上NRP-1特異性結(jié)合。
　　2.NRP-1 mAb可以抑制肝癌細(xì)胞增殖、集落形成并誘導(dǎo)凋亡，