抗ATPaseF1單克隆抗體的制備及其對肝癌細胞增殖及侵襲的影響.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文抗ATPaseF1單克隆抗體的制備及其對肝癌細胞增殖及侵襲的影響姓名：王怡波申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：沈鋒20090501碩士學(xué)位論文目的研究人類肝癌中ATPaseFI的表達情況。制備ATP合成酶F1結(jié)構(gòu)域單克隆抗體，鑒定所得單抗的特異性。詳細探討ATPaseFI在人類肝癌細胞株HepG2中的表達，證實ATPaseFI在HepG2細胞株與肝正常細胞株L02細胞膜上蛋白表達的差異，以及研究ATPase

2、Fl抗體對HepG2細胞株增殖能力與遷移能力的影響。方法1采用EnVision免疫組織化學(xué)方法檢測38例PLC配對標本中ATPaseFI表達情況。2提純牛心肌線粒體F1一ATPase，免疫BALB／Cd、鼠。通過雜交瘤技術(shù)，篩選分泌抗hATPaseFl單抗的雜交瘤細胞株。采用ProteinA親和層析法純化抗體腹水，SDS—PAGE檢測純化產(chǎn)物純度。3利用Westernblot、細胞免疫熒光、ELISA對所得單抗特異性進行鑒定，單抗亞型檢

3、測ELISA試劑盒檢測單抗亞型。4運用蔗糖梯度離心法分離出細胞膜結(jié)構(gòu)，繼以PIERCEKIT改良法抽提細胞膜蛋白，抽提產(chǎn)物用COXI單抗驗證以排除線粒體膜蛋白的干擾，再以免疫印跡法(Westernblot)檢測HepG2細胞株與肝正常細胞株L02細胞膜上ATPaseFI的蛋白表達差異。5運用細胞免疫熒光及流式細胞技術(shù)證實ATPaseFI在HepG2細胞株與肝正常細胞株L—02細胞膜上表達的差異。6利用細胞增殖實驗(CCK8assay)檢

4、測ATPaseFI單抗對HepG2細胞生長增殖的影響。利用劃痕愈合試驗(Wound—healingassay)和Transwell小室侵襲實驗觀察ATPaseFI單抗對HepG2細胞遷移能力的影響。結(jié)果138例PLC腫瘤組織中ATPaseFl的中高度表達總計30例，38例癌旁對照組織的中高度表達總計11例。ATPaseFl蛋白在PLC腫瘤組織的中高度表達率顯著高于配對癌旁組織(尺001)。2獲得純化的牛心肌線粒體FIATPase。篩選出

5、了針對hATPaseFl特異性較強的穩(wěn)定雜交瘤細胞株5GlO。用間接ELISA法測雜交瘤細胞5GlO培養(yǎng)上清的抗體滴度為1：104；小鼠腹水的滴度大于1：106。采用ProteinA親和層析法純化腹水抗體，檢測抗體滴度大于l：106，洗脫峰SDS—PAGE鑒定表明純度大于95％。3用SigmaImmunoType硼Kit檢測Mab5GlO屬IgGl型。HepG2細胞全蛋白和提純的牛心肌線粒體ATPaseFl進行Westernblot結(jié)果