脂溶性EGCG對肝癌細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　肝癌是我國危害最大的惡性腫瘤之一，我國肝癌發(fā)病人數(shù)約占全球的55％，死亡率約占全球的50％[1]。手術(shù)切除是肝癌患者的首選治療方案，然而原發(fā)性肝癌的手術(shù)復(fù)發(fā)率高，進(jìn)展快，患者后期往往伴隨慢性肝硬化、腹水和黃疸等并發(fā)癥。傳統(tǒng)的化療藥物副作用大，因此開發(fā)副作用小的天然化合物作為治療和減輕后期肝癌患者痛苦的輔助治療手段是很有必要的。
　　黃酮類化合物是廣泛存在于植物界的酚類天然化合物，包括黃酮、黃烷醇、異黃酮、黃酮醇等

2、。黃酮類化合物具有治療心血管疾病、抗炎、抗腫瘤、抗輻射、抑制微生物、提高免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等功能，并且易獲取、副作用小，因此一直備受關(guān)注。清除自由基、抗氧化、改變酶的活性等是黃酮類化合物主要的藥理作用機(jī)制。
　　茶多酚是上述黃酮類化合物中常用的抗氧化植物化學(xué)物。大量的流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)長期飲茶可以降低患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，許多體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明茶多酚及其主要有效成分EGCG具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用[2，3]。然而普通茶多酚，即水溶性茶多

3、酚的穩(wěn)定性差、吸收率較低，即使體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，卻因?yàn)樵隗w內(nèi)達(dá)不到有效濃度而在臨床應(yīng)用時受到限制[4，5]。EGCG是茶多酚的主要有效成分，脂溶性EGCG是將EGCG進(jìn)行酯化修飾后得到的帶不同酯基的混合物。酯化后的EGCG吸收率和穩(wěn)定性都更好。本實(shí)驗(yàn)旨在用體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索脂溶性EGCG(L-EGCG)對肝癌細(xì)胞的抑制作用。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)的小鼠肝癌H22細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞，分別給予0

4、、10、20、40、80μg/ml L-EGCG作用24h，光鏡下觀察細(xì)胞生長情況;分別用CCK8和MTT法檢測不同濃度L-EGCG作用于兩種細(xì)胞12、24、48h時的細(xì)胞毒性;Hoechst/PI雙染色觀察細(xì)胞凋亡率;提取蛋白，Western Blot檢測L-EGCG對肝癌細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白的影響。
　　探索用H22細(xì)胞制作ICR小鼠腋下荷瘤模型的最佳成瘤細(xì)胞數(shù)，采用該細(xì)胞數(shù)制作穩(wěn)定的ICR小鼠腋下荷瘤模型，第二天分別以腹腔

5、注射途徑給予25mg/kg環(huán)磷酰胺，灌胃給予40mg/kg水溶性茶多酚(H-EGCG)、玉米油、25mg/kgL-EGCG、50mg/kg L-EGCG和100mg/kg L-EGCG，每天一次、連續(xù)十天，處死、解剖觀察L-EGCG對腋下移植瘤的抑制作用，計(jì)算抑瘤率，并與環(huán)磷酰胺和H-EGCG組進(jìn)行對比。
　　探索將HepG2細(xì)胞注射到裸鼠肝臟制作裸鼠原位移植瘤模型的手術(shù)切口位置、最佳細(xì)胞數(shù)、注射方法和位置，制作穩(wěn)定的HepG2裸

6、鼠原位移植瘤模型。術(shù)后第二天分別以腹腔注射途徑給予25mg/kg環(huán)磷酰胺，灌胃給予40mg/kg水溶性茶多酚(H-EGCG)、玉米油、25mg/kg L-EGCG、50mg/kg L-EGCG和100mg/kgL-EGCG，每天1次、每周5天，分別于1個月和3個月兩個時間點(diǎn)，處死小鼠，解剖觀察L-EGCG對肝臟原位移植瘤的抑制作用，計(jì)算抑瘤率。對3個月時間點(diǎn)的小鼠，觀察生存時間，并取肝標(biāo)本做HE染色和Masson染色，觀察組織學(xué)變化。<

7、br>　　結(jié)果：
　　L-EGCG作用于肝癌細(xì)胞24h后，與對照組(DMSO)相比，光鏡下形態(tài)學(xué)有明顯的改變，隨著L-EGCG濃度增加，越來越多的細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、折光率變差、出現(xiàn)細(xì)胞碎片。CCK8和MTT檢測結(jié)果顯示，L-EGCG在12h、24h、48h對H22細(xì)胞和HepG2細(xì)胞均有抑制作用，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系和時間效應(yīng)關(guān)系。Hoechst/PI熒光染色顯示，L-EGCG使兩種肝癌細(xì)胞凋亡率增加。Western Blot結(jié)果顯示，

8、L-EGCG增加了PARP剪切，使自噬相關(guān)蛋白p62表達(dá)增多，LC3Ⅱ出現(xiàn)積累，說明誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，同時抑制了自噬。
　　ICR小鼠腋下注射100μl含106個H22細(xì)胞的細(xì)胞懸液，可以獲得較穩(wěn)定的ICR小鼠荷瘤模型。給藥10天后，與玉米油對照組相比，25、50mg/kg L-EGCG可以明顯減小ICR小鼠H22細(xì)胞移植瘤的瘤重(p＜0.05)。
　　經(jīng)反復(fù)探索，成功建立了HepG2細(xì)胞裸鼠原位移植瘤模型，該模型成功的關(guān)鍵因

9、素包括合適的細(xì)胞濃度和注射體積（5μl，含2.5×105個細(xì)胞）、肝臟左外葉合適的注射角度和位置、注射后止血、防止細(xì)胞漏出等。建立穩(wěn)定的模型，給藥1個月后，與玉米油組相比，L-EGCG特別是50mg/kg組可以顯著降低肝臟原位移植瘤的瘤重(p＜0.05)。給藥3個月后，玉米油組小鼠死亡一半(3/6)，環(huán)磷酰胺組小鼠的移植瘤雖然瘤重減輕，但小鼠死亡并沒有減少(3/6)，給予25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg L-EGCG的小

10、鼠，生存數(shù)量增多，分別為5/6、6/6、4/6。雖然進(jìn)行生存分析，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，但這可能是由于樣本量較小的原因。HE染色和Masson染色發(fā)現(xiàn)L-EGCG可以促進(jìn)移植瘤組織壞死，減輕肝纖維化。
　　結(jié)論：
　　1.L-EGCG對H22細(xì)胞和HepG2細(xì)胞均有抑制作用，可能與誘導(dǎo)凋亡、阻斷自噬后期有關(guān);
　　2.L-EGCG抑制ICR小鼠腋下移植瘤移植瘤和裸鼠原位移植瘤的生長;荷瘤裸鼠生存率有延長趨勢。