抗PEG10單克隆抗體的制備及在肝癌中的初步應(yīng)用.pdf

1、長期以來，肝癌發(fā)病率高，惡性度高，死亡率高。早期發(fā)現(xiàn)、早期治療是提高患者生存率的關(guān)鍵。甲胎蛋白（Alpha Fetoprotein，AFP）是當(dāng)前臨床上判斷原發(fā)性肝細(xì)胞腫瘤（Hepatic Cell Carcinoma HCC）的重要標(biāo)志物，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，但容易造成相當(dāng)數(shù)量的誤診和漏診。所以開發(fā)更新、更特異、更敏感的肝癌分子標(biāo)志物成為當(dāng)前非常緊迫的課題。近年有研究表明父系表達(dá)基因PEG10（paternally expressed g

2、ene10，PEG10）與HCC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，且在肝癌組織中的表達(dá)敏感性與AFP接近，但比AFP具有更高的肝癌組織特異性。因此PEG10基因很可能成為一種新的分子標(biāo)志物，在肝癌的診斷、個(gè)體化治療及預(yù)后判斷等方面發(fā)揮重要作用。目前，該分子表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系等還有待進(jìn)一步深入研究。因此，制備高特異性抗PEG10單克隆抗體有重要意義。本實(shí)驗(yàn)小組通過合成PEG10抗原多肽，偶聯(lián)KLH，免疫Balb/c雌鼠，采用雜交瘤技術(shù)制備單克降

3、抗體（McAb），采用離子交換層析對小鼠IgG腹水進(jìn)行了純化，獲得兩個(gè)純化的抗體，分別命名為3E8和3F3。在此基礎(chǔ)上，以細(xì)胞系HepG2，HepG2.215，MHCC-97L，BEL-7404，SMMC-7721，L02，HO8910，EC9706為受試細(xì)胞，考察各細(xì)胞系中PEG10的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討在15對肝癌和鄰近癌旁組織的表達(dá)情況，以及不同分級的肝癌組織中的表達(dá)情況，為該基因的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
　　 目的：

4、>　　 1、PEG10-RF1抗原表位進(jìn)行預(yù)測，合成相應(yīng)肽段，將其與合適載體偶聯(lián)，制備PEG10單克降抗體（McAb）。
　　 2、PEG10單克降抗體（McAb）進(jìn)行特性鑒定及McAb的純化。
　　 3、純化的抗體進(jìn)行臨床上的初步應(yīng)用。
　　 方法：
　　 1、采用Antigen Design Tool軟件分析PEG蛋白的空間結(jié)構(gòu)，計(jì)算得出優(yōu)勢抗原表位，通過高效液相色譜（HPLC）分析法和電噴霧質(zhì)譜（

5、ESI-MS）分析法對合成出來的抗原進(jìn)行鑒定。
　　 2、通過細(xì)胞融合技術(shù)，以PEG10抗原免疫Balb/c小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。通過多次陽性篩選和有限稀釋，建立了抗人PEG10單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
　　 3、采用離子交換層析對小鼠IgG腹水進(jìn)行了純化，利用SDS-PAGE電泳、間接ELISA法、Western blot方法、免疫組織化學(xué)方法對單克降抗體的特性進(jìn)行鑒定。
　　 4、采用W

6、estern blot方法檢測不同細(xì)胞系中PEG10表達(dá)情況。
　　 5、采用免疫組織化學(xué)方法檢測不同分級肝癌組織、癌旁組織中PEG10表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功獲得PEG10-RF1抗原多肽，并與KLH相偶聯(lián)。合成多肽經(jīng)高效液相色譜分析為單一峰，純度達(dá)到85％以上，電噴霧質(zhì)譜分析顯示分子量的測定值符合理論值，經(jīng)鑒定符合要求。
　　 2、雜交瘤細(xì)胞株的建立融合率達(dá)95％，陽性率為15％，最終

7、獲得兩株穩(wěn)定分泌抗PEG10抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3E8和3F3。
　　 3、制備并純化了兩株（3E8和3F3）抗PEG10單克隆抗體，經(jīng)鑒定該兩株抗PEG10單克降抗體的Ig亞類均為IgG1。純化后的兩株單克降抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳，根據(jù)BD凝膠成像系統(tǒng)里的Quantity one軟件計(jì)算，所制備抗體純度達(dá)85％以上。用間接ELISA方法測定PEG10單抗均不與無關(guān)抗原結(jié)合反應(yīng)，表明特異性好。按照SouthernB

8、iotech試劑盒說明書對陽性雜交瘤培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示兩株細(xì)胞分泌的單抗均為IgG1類，輕鏈均為κ鏈。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備出的3E8株單抗能和天然PEG10蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而3F3株單抗不能與天然PEG10蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩株抗PEG10單克隆抗體與肝細(xì)胞肝癌組織反應(yīng)后均能，生成棕色或棕褐色沉淀，主要位于肝癌細(xì)胞的胞質(zhì)。
　　 4、Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

9、明，五株肝癌細(xì)胞系PEG10蛋白均有較強(qiáng)的表達(dá)，而正常肝細(xì)胞系L02和卵巢癌細(xì)胞系HO8910、食管癌細(xì)胞系EC9706均不表達(dá)。PEG10蛋白。
　　 5、免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同一病例的肝癌組織高表達(dá)PEG10蛋白，而相應(yīng)的鄰近癌旁組織低表達(dá)或不表達(dá)PEG10蛋白。在不同分級的肝癌組織中，PEG10蛋白的表達(dá)量是不同的，肝癌組織惡性程度越高，PEG10蛋白的表達(dá)量也越高。
　　 結(jié)論：
　　 1、得到兩株

10、特異性較好的抗PEG10單克隆抗體，均為IgG1類，輕鏈均為κ鏈，分別命名為3E8和3F3。
　　 2、PEG10在已檢測的肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)，而在正常肝組織和肝細(xì)胞中以及其它器官的腫瘤細(xì)胞株均不表達(dá)，提示PEG10具有高度組織特異性。
　　 3、PEG10在已檢測的不同分化程度的肝癌組織中表達(dá)量不同，且惡性程度越高，PEG10表達(dá)量越高；惡性程度越低，PEG10表達(dá)量越低，提示PEG10表達(dá)量與惡性程度具有一