肝腸鈣粘連蛋白單克隆抗體的制備鑒定及其對HepG2的生長抑制作用.pdf

1、肝癌是肝臟最常見的原發(fā)腫瘤，其中肝細胞肝癌（heptocellular carcinoma，HCC）在我國占原發(fā)性肝癌的90%[1]。全世界每年死于此病約一百萬人[2]，晚期肝癌預后差，總體5年生存率小于5%。 首先，原發(fā)性肝癌的惡性程度高、危害大，多數(shù)患者未能早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷，就診時多數(shù)屬于中晚期，失去手術機會，因此，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療是提高HCC患者生存和預后的重要因素，診斷陽性率的提高對HCC患者生存率及生存質(zhì)

2、量改善至關重要。甲胎蛋白（AFP）臨床應用主要有兩點：首先發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測原發(fā)性肝細胞癌，其次監(jiān)測治療效果。雖然AFP檢測已廣泛用于原發(fā)性肝癌的診斷中，但由于某些肝癌細胞不分泌此種糖蛋白。故在這些原發(fā)性肝癌患者體內(nèi)無法測到異常的AFP。而在某些慢性肝病、肝硬化及生殖腺胚胎癌時，患者血清中的AFP也有中等水平的表達。所以僅憑AFP診斷原發(fā)性肝癌易造成漏診和誤診，故其臨床應用受到一定限制。 其次，轉移和復發(fā)也是影響肝癌生存率的主要因素[3

3、]。探討肝癌發(fā)生發(fā)展、轉移復發(fā)相關分子機制、及尋找新的干預靶點已經(jīng)成為肝癌研究的重點和難點。 在肝癌的治療方面，對于不能手術切除的晚期肝癌，肝動脈介入化療栓塞療法和化療是最主要的治療手段，但無論是介入治療還是化療，都只能使少部分患者獲益，大部分患者療效不佳，而且也不能為患者帶來生存受益。如阿霉素是傳統(tǒng)的用于肝癌治療的藥物，但緩解率僅為10%～15%，且不能延長患者的生存時間。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，新的生物治療藥物

4、不斷涌現(xiàn)，生物靶向治療已逐漸成為晚期肝癌病人的新選擇、新希望。現(xiàn)階段，分子靶向治療和以此為基礎的放射免疫靶向治療在晚期肝癌的治療上取得了令人鼓舞的良好療效，逐漸成為晚期HCC病人的首選治療手段。 肝腸鈣粘連蛋白（CDH17）包含了832個氨基酸殘基，分子量約92.3kD，屬于鈣粘連蛋白家族成員，但其結構特點和生物學行為均與傳統(tǒng)的鈣粘連蛋白有所不同。CDH17細胞外部分具有7個結構域，細胞粘附識別區(qū)域（cell adhesion

5、recognition CAR）介導鈣粘連蛋白的特異性粘附，細胞質(zhì)部分含有20個氨基酸殘基[4]。有研究表明，CDH17的胞外部分可能獨自擔當調(diào)節(jié)細胞粘附功能的工具[5]。正常情況下，CDH17限制性地表達在鼠的肝臟及大腸小腸細胞內(nèi)，而在食管和胃從未發(fā)現(xiàn)CDH17的存在。鈣粘連蛋白是Ca2+依賴的細胞之間的粘附分子，它們在胚胎的發(fā)生發(fā)育及組織器官的形成和結構維持中發(fā)揮了重要的作用。如果鈣粘連蛋白功能紊亂將會使細胞之間的粘附力下降，細胞和

6、組織形態(tài)改變，從而出現(xiàn)細胞遷移。這個現(xiàn)象出現(xiàn)在腫瘤組織中將會導致腫瘤細胞向外周浸潤或轉移。因此，鈣粘連蛋白可視為腫瘤患者的病情及預后檢測指標之一。盡管CDH17的結構與傳統(tǒng)鈣粘連蛋白不同，但在上述功能中也起到了同等重要的作用。CDH17的功能紊亂將導致腫瘤細胞的外周浸潤及轉移，最終導致腫瘤復發(fā)及總體生存率的下降，一系列研究的結果提示CDH17可能成為胃癌、結腸癌及肝癌等腫瘤診斷和/或預后的指標，監(jiān)測腫瘤的進展及復發(fā)[6-18]。但CDH

7、17在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用還不十分明確，制備CDH17的單克隆抗體將為CDH17的功能研究提供條件。 本研究以純化的重組CDH17為免疫原，利用經(jīng)典的淋巴細胞融合技術，建立了穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株，對得到的單克隆抗體進行了純化和鑒定，并用Western-Blot和免疫組織化學實驗對所制備的抗體進行了驗證，再用制備出的抗CDH17單克隆抗體作用于人肝癌HepG2細胞，探討其抑制肝癌細胞增殖的作用，為進一步研

8、究CDH17的功能奠定了基礎。 目的: 制備及鑒定肝腸鈣粘連蛋白（CDH17）的單克隆抗體，研究其對肝癌細胞系HepG2的生長抑制作用，為探討CDH17蛋白的生物學功能奠定基礎。 方法: 1.動物免疫選用BALB/c小鼠，用純化的蛋白免疫，間接ELISA檢測血清抗體效價達1：6400以上。 2.細胞融合末次免疫后3d取小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合。 3.雜交瘤細胞株的制備和篩選

9、采用間接ELISA方法，用純化的重組CDH17融合蛋白篩選只與CDH17反應的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，行1次亞克隆及2-3次單克隆。 4.誘生腹水和抗體的純化在預先1周注射石蠟油致敏的BALB/c小鼠腹腔接種已建株的雜交瘤細胞，采集腹水，通過Protein-G親和層析柱純化，SDS-PAGE分析純化結果。 5.Western-Blot分析取分別含肝癌細胞系HepG2、QGY7703、Be17402、CBRH7919的上

10、樣進行SDS-PAGE電泳，一抗加入抗CDH17單克隆抗體細胞株培養(yǎng)上清F001和F002（原液）。 6.免疫組織化學分析收集經(jīng)手術切除的病理證實為原發(fā)性肝細胞癌的組織標本，用制備的單克隆抗體進行免疫組化染色以分析CDH17在原發(fā)性肝細胞癌組織中的表達情況。對照組以PBS代替第一抗體。 7.單抗作用于HepG2后細胞形態(tài)的觀察取對數(shù)生長期HepG2細胞接種于6孔板，培養(yǎng)12 h后加入不同濃度的抗CDH17單克隆抗體，其終

11、濃度分別為0（對照組，加入同體積的培養(yǎng)基）、5ug/ml、10 ug/ml、20 ug/ml、40 ug/ml、80 ug/ml，藥物處理后24、48、72和96h在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細胞形態(tài)學變化并拍攝記錄細胞形態(tài)。 8.MTT法檢測各濃度單抗對腫瘤細胞增殖的抑制取對數(shù)生長期HepG2細胞接種于96孔板，培養(yǎng)12 h后加入不同濃度的抗CDH17單克隆抗體，其終濃度分別為0（對照組，加入培養(yǎng)基）、5ug/ml、10 ug/ml

12、、20 ug/ml、40 ug/ml、80 ug/ml，分別培養(yǎng)24、48、72和96h后用MTT法檢測各濃度單抗對腫瘤細胞增殖的抑制。 9統(tǒng)計學處理實驗所得數(shù)據(jù)應用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行處理。以析因設計的資料方差分析對各濃度組及各時間組的抑制率進行差異性分析，并用SNK法分別對其進行兩兩比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。 結果: 1.雜交瘤細胞株的建立 獲得分泌穩(wěn)定的單克隆抗體雜交瘤細胞株2

13、株，命名為F001和F002。 2.McAb的效價 ELISA檢測兩株單抗（F001和F002）的細胞培養(yǎng)上清抗體效價為1：128和1：1024，腹水效價為1：25600和1：51200。 3.抗體的純度測定 純化后的2株單克隆抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳，抗體純度達80%以上。 4.Western blot結果 結果顯示CDH17在HepG2、QGY7703、 Be17402和CBRH7

14、919中均有不同程度的表達，2株單抗均能檢測到與CDH17（約92.3KD）預測分子量大小一致的特異條帶。表明以重組純化的CDH17為免疫原產(chǎn)生的McAb可與真核細胞內(nèi)的天然CDH17抗原結合。 5.免疫組化染色結果 兩株抗CDH17單克隆抗體與原發(fā)性肝細胞癌組織反應后均能生成棕色或棕褐色沉淀，主要位于肝癌細胞的胞質(zhì)，陰性對照未見棕色或棕褐色沉淀。 6.單抗作用于HepG2后細胞形態(tài)學改變 加藥24、48

15、、72和96h后，對照組細胞生長良好、數(shù)量隨生長時間增長而增多，細胞大小均勻、形態(tài)一致并呈多邊形，高倍鏡下可見細胞染色質(zhì)疏松、胞質(zhì)豐富。實驗組細胞培養(yǎng)48h后，各實驗組均可見細胞數(shù)量明顯減少，細胞大小不一，形態(tài)不規(guī)則，部分細胞變圓，高倍鏡可見細胞核固縮、胞質(zhì)減少以及胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，部分細胞脫壁呈半懸浮狀態(tài)，細胞數(shù)量及形態(tài)改變與藥物作用時間和濃度呈正相關。 7.MTT法檢測各濃度單抗對腫瘤細胞增殖的抑制 經(jīng)析因方差分析得不

16、同藥物濃度之間及不同作用時間之間的平均抑制率存在顯著差異，且兩因素之間存在交互效應。說明藥物濃度和作用時間兩因素對抑制率起相互促進的作用。再進行單獨效應分析，相同作用時間不同藥物濃度之間及相同藥物濃度不同作用時間之間的抑制率存在顯著差異，不全相同。進一步用SNK法對單獨效應進行兩兩比較的結果顯示，除了80ug/ml藥物濃度下作用72h與96h無顯著差異外，相同作用時間不同藥物濃度之間及相同藥物濃度不同作用時間之間均存在顯著性差異。證明了

17、抗CDH17單克隆抗體對HepG2細胞增殖的抑制作用隨濃度的增加和作用時間的延長，其對細胞增殖的抑制作用逐漸增強，但當藥物濃度達到80ug/ml時，作用72h或作用96h并無顯著差異。 結論: 本實驗運用雜交瘤技術成功篩選并制備出2株抗CDH17的單克隆抗體細胞株，并對其特異性進行鑒定，經(jīng)Western-blot和免疫組織化學鑒定，顯示制備的2株單克隆抗體均能和人肝癌細胞株以及人原發(fā)性肝癌病理標本發(fā)生特異性反應，表明制備