膠原樣結(jié)構(gòu)巨噬細胞受體介導(dǎo)的線粒體凋亡在染矽塵大鼠肺纖維化中的作用.pdf

1、目的：1、通過抑制肺泡巨噬細胞（Alveolar macrophage, AM）表面膠原樣結(jié)構(gòu)巨噬細胞受體（Macrophage receptor with collagenous structure, MARCO）及線粒體凋亡通路相關(guān)靶點后檢測AM內(nèi)活性氧（Reactive oxygen specises, ROS）及線粒體膜電位變化水平，肺組織MARCO、細胞色素C（Cytochrome C, CytC）、天冬半胱氨酸特異性蛋白-9

2、（Cysteinyl aspartate specific protease-9, Caspase-9）、Caspase-3、B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 assioated X protein, Bax）水平，探討MARCO介導(dǎo)的肺泡巨噬細胞線粒體凋亡通路發(fā)生機制。2、通過檢測肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平，觀察肺組織病理變化，

3、分析線粒體凋亡通路在矽肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用。3、通過比較矽肺形成前的預(yù)防性干預(yù)措施與矽肺形成后的治療性干預(yù)措施對染矽塵大鼠各指標(biāo)的不同影響，探討不同時段干預(yù)措施的療效。
　　對象與方法：無特定病原體級健康成年雄性SD大鼠176只按體重隨機分為6組：生理鹽水對照組（24只）、矽肺模型組（24只）、N-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine, NAC）組（32只）、環(huán)孢霉素A（Cyclosporin A, CsA）組（32

4、只）、Caspase-9抑制劑組（32只）、多聚鳥苷酸（Polyguanylic acid, PolyG）組（32只），各組按照施加干預(yù)的時間點不同分為預(yù)防組和治療組，預(yù)防性及治療性干預(yù)均設(shè)置后續(xù)觀察組（繼續(xù)觀察28天）。除生理鹽水對照組外，其余各組均進行矽肺造模。各預(yù)防組大鼠自造模當(dāng)天開始給予不同的干預(yù)處理，分別于染塵后第28天、第56天處死大鼠各8只；治療組大鼠于造模28天后給予不同的干預(yù)處理，分別于染塵后第56天、第84天處死大鼠

5、各8只。收集左側(cè)肺泡灌洗液，分離純化AM，流式細胞術(shù)檢測線粒體去極化率和ROS陽性率；取左肺組織適量，實時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）分析Ⅰ型和Ⅲ型前膠原mRNA表達水平；取適量肺組織勻漿、細胞裂解后，免疫印跡法測定肺組織內(nèi)MARCO、Bcl-2、Bax、CytC、Caspase-9和Caspase-3水平。右側(cè)肺組織經(jīng)多聚甲醛固定，常規(guī)制作石蠟切片，蘇木素-伊紅染色觀察肺組織病理變化。
　　結(jié)果：1、不同

6、組別大鼠肺組織病理變化。生理鹽水對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清楚，肺泡壁薄，但肺間質(zhì)有輕微炎癥；矽肺模型組大鼠肺組織內(nèi)有炎細胞浸潤，以淋巴細胞和巨噬細胞滲出為主，出現(xiàn)了典型的纖維性結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)由巨噬細胞和成纖維細胞構(gòu)成，可見程度不同的肺泡壁和小血管壁增厚，以結(jié)節(jié)處增厚更為顯著，隨著染塵時間的延長矽結(jié)節(jié)數(shù)量增多，部分矽結(jié)節(jié)出現(xiàn)了融合；NAC組、CsA組、Caspase-9抑制劑預(yù)防組和和PolyG組大鼠肺組織均未見細胞性結(jié)節(jié)或矽結(jié)節(jié)，Caspase

7、-9抑制劑治療組有散在的細胞性結(jié)節(jié)，但各組均有普遍的炎細胞浸潤，隨著觀察時間的延長，炎癥改變均出現(xiàn)了不同程度的緩解，以PolyG組減輕最為顯著，但各組大鼠肺組織均有肺氣腫現(xiàn)象。2、不同組別大鼠AM線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白含量比較。染塵后第28d、56d和84d生理鹽水對照組間大鼠肺組織MARCO、CytC、Caspase-9、Caspase-3、Bax和Bcl-2水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），矽肺模型組大鼠肺組織除Bcl-2含量

8、隨觀察時間延長減少外，其他蛋白水平均隨觀察時間延長增加（P<0.05）。NAC組及CsA組（預(yù)防性和治療性）大鼠肺組織MARCO、CytC、Caspase-9、Caspase-3和Bax含量均高于同期生理鹽水對照組，但低于矽肺模型組，Bcl-2含量較矽肺模型組高，生理鹽水對照組低（P<0.05）；染塵后第28d、第56d Caspase-9抑制劑組（預(yù)防性及治療性）大鼠肺組織CytC與同期矽肺模型組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）

9、，其他指標(biāo)均與NAC組趨勢一致；與相應(yīng)生理鹽水對照組比較，染塵后第28d PolyG預(yù)防組大鼠肺組織MARCO及CytC差異無統(tǒng)計學(xué)意義，染塵后第56d PolyG預(yù)防組MARCO、CytC、Caspase-3和Bax差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其他指標(biāo)與NAC組趨勢一致。3、不同組別大鼠AM內(nèi)ROS含量及線粒體膜電位變化水平。染塵后第28d、56d和84d生理鹽水對照組間大鼠AM ROS陽性率和線粒體膜電位去極化率均低于相應(yīng)矽肺

10、模型組（P<0.05）；NAC組及CsA組（預(yù)防性和治療性）大鼠AM ROS陽性率和線粒體膜電位去極化率均高于同期生理鹽水對照組，但低于矽肺模型組（P<0.05）；染塵后第28d Caspase-9抑制劑預(yù)防組大鼠AM ROS陽性率與同期矽肺模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其他指標(biāo)均與NAC組趨勢一致；染塵后第56d PolyG預(yù)防組大鼠AM ROS陽性率與同期生理鹽水對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其他指標(biāo)均與

11、NAC組趨勢一致。4、不同組別大鼠肺組織細胞Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平分析。染塵后第28d、56d和84d生理鹽水對照組間大鼠肺組織Ⅰ型前膠原mRNA表達水平逐漸升高（P<0.05），Ⅲ型前膠原mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；矽肺模型組大鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平均隨染塵時間延長而增加（P<0.05）；NAC組、CsA組和Caspase-9抑制劑組（預(yù)防性和治療性）兩指標(biāo)均高于同期生理鹽水對照組，低于矽

12、肺模型組（P<0.05）；與相應(yīng)生理鹽水對照組比較，PolyG預(yù)防組大鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平均無統(tǒng)計學(xué)差異，但均低于矽肺模型組，PolyG治療組兩指標(biāo)與NAC組趨勢一致。5、不同干預(yù)時段對不同組別大鼠AM線粒體凋亡通路相關(guān)指標(biāo)的影響。染塵后第28d各預(yù)防組與染塵后第56d各相應(yīng)治療組比較，生理鹽水對照組大鼠肺組織MARCO、CytC、Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平，

13、AM ROS陽性率和線粒體膜電位去極化率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），Ⅰ型前膠原mRNA表達水平降低（P<0.05）；矽肺模型組大鼠AM ROS陽性率和線粒體膜電位去極化率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），肺組織Bcl-2水平升高，其他指標(biāo)均降低（P<0.05）；NAC組、CsA組和PolyG組大鼠上述指標(biāo)除Bcl-2升高外，其他指標(biāo)均降低（P<0.05）；Caspase-9抑制劑組大鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平、AM線

14、粒體膜電位去極化率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），Bcl-2含量升高，其他指標(biāo)均降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：1、抑制MARCO及線粒體通路相關(guān)靶點后，肺泡巨噬細胞內(nèi)ROS及線粒體膜電位變化水平，肺組織 MARCO、CytC、Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2水平均出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，表明 MARCO結(jié)合二氧化硅在肺泡巨噬細胞線粒體凋亡通路啟動中發(fā)揮著重要的作用。2、抑制 MARCO及線粒體通路相關(guān)靶