先天性進行性皮質(zhì)點狀白內(nèi)障相關候選基因定位及功能研究.pdf

1、研究背景：
　　白內(nèi)障是目前我國乃至世界首位的致盲原因。其中，先天性白內(nèi)障已成為兒童失明和視力障礙的主要原因，國外報道其發(fā)病率為(1-6)/萬，居兒童失明原因的第二位。先天性白內(nèi)障的發(fā)病原因眾多，機制復雜，目前認為約1/3與遺傳因素有關。因此，疾病相關候選基因和突變方式的研究成為遺傳性白內(nèi)障的研究熱點。迄今為止，已經(jīng)鑒定和克隆的與遺傳性白內(nèi)障有關的致病基因至少有26個，相關的突變型更是多達40余種。然而，遺傳性白內(nèi)障具有明顯的遺傳

2、異質(zhì)性（即同一基因型可具有不同的臨床表型，而同一臨床表現(xiàn)也可由不同的基因型決定），其形態(tài)不一的臨床表型無疑為致病基因的鑒定增加了困難。同時，隨著人類基因組計劃的完成，各項研究特別是遺傳性疾病的研究將逐漸迎來“后基因組時代”，即對致病基因的功能以及突變蛋白具體致病機制的研究。因此，遺傳性白內(nèi)障致病基因的鑒定和功能研究，不僅將進一步豐富目前已知的疾病相關基因庫，為開展遺傳性白內(nèi)障的產(chǎn)前診斷和基因診斷作出貢獻，而且有助于揭示晶狀體混濁的發(fā)病機

3、制，為理解白內(nèi)障的致病機制和后續(xù)相關的基因治療奠定基礎。本文就我們收集的我國浙江省地區(qū)一個先天性進行性皮質(zhì)點狀白內(nèi)障家系進行致病基因定位和突變蛋白功能研究。
　　研究方法：
　　對參與本次研究的家系成員進行詳細的家族史及臨床資料的采集，并對所有的家系成員進行全面的眼科檢查，包括視力、裂隙燈、散瞳眼底檢查等。根據(jù)系譜行遺傳方式分析，初步確定家系的遺傳方式。提取家系成員外周血樣本并抽提基因組DNA，應用聚合酶鏈反應(PCR)擴增

4、疾病相關的候選基因的所有外顯子及內(nèi)含子外顯子交界區(qū)，利用直接測序法確定致病的突變基因及位點，借助生物信息學方法(Polyphen-2 and SIFT)對突變基因的結構和功能進行分析。以正常人晶狀體cDNA文庫為模板，通過PCR反應獲得野生型目的基因的cDNA序列，利用DNA重組技術克隆至真核表達載體pcDNA3.1-，利用定點突變技術構建攜帶突變基因的質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染至人宮頸癌上皮細胞(HeLa)，免疫熒光技術檢測HeLa細胞中AQP0

5、的表達并采用激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白定位。
　　結果：
　　1、臨床檢查表明此遺傳性白內(nèi)障家系的表型為皮質(zhì)點狀混濁，呈進行性，遺傳方式為常染色體顯性遺傳。針對家系候選基因進行突變篩查，對CRYAA、CRYBA1、CRYGD、CRYGS、MIP、GJA3六個候選基因進行測序，發(fā)現(xiàn)在MIP基因第2號外顯子第88個堿基發(fā)生了G→C的置換(c.448 G＞C)，該突變使得MIP編碼的AQP0蛋白的第150個氨基酸（位于Loop D區(qū)

6、段）發(fā)生天冬氨酸到組氨酸的轉(zhuǎn)變(p.D150H)，家系中參與研究的正常人及200名正常對照組成員均未檢測到此突變存在，PolyPhen-2和SIFT分數(shù)均提示D150H為影響蛋白質(zhì)結構和功能的有意義的突變。
　　2、分別成功構建表達野生型AQP0蛋白的質(zhì)粒pcDNA3.1-wtAQP0及表達突變蛋白的pcDNA3.1-AQP0D150H，轉(zhuǎn)染HeLa細胞后，免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)突變蛋白在細胞內(nèi)聚集較多，細胞膜上定位較野生組明顯減少，提