先天性蝸牛殼樣白內(nèi)障疾病相關(guān)候選基因的定位和克隆.pdf

1、隨著當(dāng)代眼科學(xué)手術(shù)技術(shù)不斷改進(jìn)和基礎(chǔ)研究的飛速發(fā)展，先天性白內(nèi)障的診斷、治療及預(yù)后都有了很大的提高，但它仍然是導(dǎo)致兒童盲的首要原因。如果不能得到及時(shí)和正確的治療，混濁的晶狀體會(huì)阻礙物體在視網(wǎng)膜上的清晰成像，影響視網(wǎng)膜皮質(zhì)突觸連接的發(fā)育，最終導(dǎo)致不可逆的弱視。大約50％的先天性白內(nèi)障與遺傳有關(guān)，其中最常見(jiàn)的遺傳方式是常染色體顯性遺傳[1]，該遺傳方式患者下一代的發(fā)病概率為50％，因此會(huì)影響整個(gè)家族的生活質(zhì)量。迄今為止，研究人員已發(fā)現(xiàn)至少1

2、9個(gè)候選位點(diǎn)以及14個(gè)白內(nèi)障疾病相關(guān)基因與常染色體顯性先天性白內(nèi)障(autosomal dominant congenital cataract，ADCC)有關(guān)，這些基因可以歸為4類(lèi)：(1)編碼晶狀體蛋白的基因，包括CRYAA[23]、CRYAB[4]、CRYBA1[5,6]、CRYBB1[7]、CRYBB2[8-10]、CRYGC[11,12]、CRYGD[12-16]以及CRYGS[17]；(2)編碼膜轉(zhuǎn)運(yùn)及通道蛋白的基因，如MIP

3、[18]，GJA3[19，20]以及GJA8[21,22]； (3)編碼細(xì)胞骨架蛋白的基因，如BFSP2[23,24];(4)編碼發(fā)育調(diào)節(jié)因子的基因，如PITX3[25]以及HSF4[26]。目前對(duì)先天性白內(nèi)障疾病相關(guān)候選基因的研究主要從兩方面著手。一方面從白內(nèi)障形成相關(guān)的功能蛋白出發(fā)，尋找其編碼基因作為突變研究中的重要侯選基因；另一方面對(duì)先天性白內(nèi)障的大樣本家系資料進(jìn)行基因組掃描和連鎖分析確定染色體定位，再篩選定位區(qū)域內(nèi)的熱點(diǎn)基因經(jīng)測(cè)

4、序發(fā)現(xiàn)突變點(diǎn)。后者是目前研究先天性白內(nèi)障疾病相關(guān)致病基因的主要方法之一。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)一個(gè)具有特殊表型(蝸牛殼樣混濁)的先天性白內(nèi)障家系進(jìn)行了研究，該家系共24人，患者分布于四代中共13人，現(xiàn)存活12人，其中男7人，女5人，均為雙眼發(fā)病。家系中患者均在出生后不久發(fā)病，白內(nèi)障形態(tài)基本一致。絕大多數(shù)患者伴有雙眼眼球震顫，未手術(shù)患眼視力最差為手動(dòng)最好為0.25。另外，家系成員中未發(fā)現(xiàn)其他眼部異常及全身疾病，可基本排除藥物和環(huán)境的影響。因該

5、家系白內(nèi)障表型獨(dú)特，國(guó)內(nèi)、外文獻(xiàn)均未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)該先天性白內(nèi)障家系進(jìn)行疾病相關(guān)候選基因的定位和克隆研究，以期找到與此獨(dú)特先天性白內(nèi)障表型相關(guān)的候選基因，并進(jìn)一步探討先天性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制及認(rèn)識(shí)人眼晶狀體發(fā)育和代謝的基因編碼及遺傳規(guī)律，為先天性白內(nèi)障的產(chǎn)前診斷和基因治療提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)獲浙江大學(xué)倫理委員會(huì)同意，并且所有家系成員均簽署知情同意書(shū)。 第一部分:先天性蝸牛殼樣白內(nèi)障家系所有家系成員均接受病史調(diào)查，并行眼科檢查，

6、包括視力、裂隙燈、散瞳眼底檢查等。根據(jù)病史、白內(nèi)障手術(shù)史或裂隙燈檢查所見(jiàn)確定成員患病與否。該家系共24人，患者分布于四代中共13人，現(xiàn)存活12人，其中男7人，女5人，均為雙眼發(fā)病。病史及裂隙燈檢查：家系中患者均在出生后不久發(fā)病，白內(nèi)障形態(tài)基本一致，呈蝸牛殼樣混濁，個(gè)別患眼還伴有皮質(zhì)騎子。絕大多數(shù)患者伴有雙眼眼球震顫，未手術(shù)患眼視力最差為手動(dòng)最好至0.25。家系成員均為足月順產(chǎn)，妊娠史均正常，可排除藥物和環(huán)境的影響，無(wú)其它眼部和全身病變。

7、根據(jù)該家系遺傳特點(diǎn)，無(wú)近親結(jié)婚、每一代男女都有患者、且男性患者的男性下一代也可患病，我們可以判斷該家系遺傳模式為常染色體顯性遺傳。 第二部分:疾病相關(guān)候選基因的定位在家系調(diào)查的基礎(chǔ)上，應(yīng)用短串聯(lián)重復(fù)序列(微衛(wèi)星位點(diǎn)，short tandem repeats sequence，STRS)為遺傳標(biāo)記的基因掃描和遺傳連鎖分析技術(shù)，進(jìn)行疾病相關(guān)候選基因的定位分析。采集包括12例患者在內(nèi)的家系成員血樣22份，使用3-Spin Blood

8、DNA Isolation(上海申能博彩生物科技有限公司)試劑盒提取基因組DNA。選取與已知18個(gè)常染色體顯性遺傳先天性白內(nèi)障相關(guān)位點(diǎn)鄰近的微衛(wèi)星位點(diǎn)共41個(gè)，分別用熒光染料標(biāo)記的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增，ABI PrismTM377XL型DNA：測(cè)序儀電泳，Genescan 3.0軟件和Geno typer 2.1(Perkin-Elmer Applied Biosyste

9、m)軟件完成等位基因的分型，運(yùn)用Linkage 5.10軟件MLink程序進(jìn)行家系兩點(diǎn)連鎖分析。兩點(diǎn)連鎖分析得出在STRS標(biāo)記D12S368和D12S83處，當(dāng)重組率θ=0時(shí)其兩點(diǎn)LOD最大值(ZMAX)分別為1.66和2.01，支持連鎖。而ADCC相關(guān)基因MIP所在區(qū)域恰好位于這兩個(gè)標(biāo)記點(diǎn)之間。在D12S368和D12S83之間，再選取3個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記D12S1586、D12S1632和D12S1691進(jìn)行連鎖分析，其中最高LOD值3.

10、08(θ=0)在STRS標(biāo)記物D12S1632處獲得，屬肯定連鎖關(guān)系。 第三部分:疾病相關(guān)候選基因的突變篩選通過(guò)對(duì)該家系先天性白內(nèi)障疾病相關(guān)候選基因MIP(編碼水通道蛋白0，aquaporin0，AQP0)基因篩選測(cè)序，顯示在MIP基因第3號(hào)內(nèi)含子3’最后一個(gè)堿基發(fā)生了雜合的G→A置換(c．607-1G>A)。在發(fā)現(xiàn)了此改變后，我們對(duì)所有的家系成員以及100個(gè)與該家系無(wú)血緣關(guān)系的正常個(gè)體進(jìn)行了限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析(Restr

11、iction Fragment Length Polymorphism Analysis，RFLP)。該點(diǎn)突變使原有的一個(gè)BstSF1限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)消失，此改變與白內(nèi)障表型完全共分離：家系中所有患者均有此改變，而健康者均無(wú)此改變，并且100個(gè)不同遺傳背景的正常對(duì)照樣本亦無(wú)此改變，提示MIP基因?yàn)榇霜?dú)特表型白內(nèi)障疾病相關(guān)基因。 第四部分: MIP基因3號(hào)內(nèi)含子隱性受體剪接位點(diǎn)的預(yù)測(cè)因該突變位點(diǎn)恰好位于MIP基因的3號(hào)內(nèi)含子受

12、體剪接位點(diǎn)處，將導(dǎo)致MIP前體mRNA無(wú)法正常剪接。通常剪接位點(diǎn)突變會(huì)出現(xiàn)外顯子丟失、替代性剪接位點(diǎn)的激活、內(nèi)含子中出現(xiàn)假外顯子及內(nèi)含子殘留等改變。用NNSPLICE程序，版本0.9(http：//www．fruitfly．org/seq_tools/splice．html)對(duì)該剪接位點(diǎn)的臨近序列進(jìn)行隱性受體剪接位點(diǎn)評(píng)分(分值范圍0～1.0)，預(yù)測(cè)可能存在的替代性受體剪接位點(diǎn)(評(píng)分大于0.4)。結(jié)果表明除原有正常受體剪接位點(diǎn)外(評(píng)分1.

13、0)，另有兩個(gè)隱性剪接位點(diǎn)評(píng)分分別為0.44和0.88。當(dāng)G→A突變發(fā)生時(shí)，原正常剪接位點(diǎn)AG變?yōu)閺?，評(píng)分也從1.0降至0.0，因此預(yù)測(cè)的兩個(gè)隱形剪接位點(diǎn)有可能被激活。第五部分異常剪接產(chǎn)生突變型MIP蛋白(AQP0)模型的計(jì)算機(jī)構(gòu)建和分析水通道蛋白0(AQP 0)是水通道蛋白家族中的一員，其主要功能為跨膜快速轉(zhuǎn)運(yùn)水分子。其主要在晶狀體終末分化纖維中表達(dá)，并占總膜蛋白的50％以上。AQP0三維結(jié)構(gòu)高度保守，對(duì)維持人晶狀體透明性和屈光性具有

14、重要作用。運(yùn)用SWISS-MODEL軟件以牛AQP0蛋白結(jié)構(gòu)為模板預(yù)測(cè)野生型和異常剪接型AQP0蛋白結(jié)構(gòu)，用SWISS-Pdb瀏覽器進(jìn)行觀察與分析。SWISS-MODEL軟件蛋白建模后發(fā)現(xiàn)MIP基因(c．607-1G>A)突變后如激活隱性受體剪接位點(diǎn)，產(chǎn)生突變型蛋白，將導(dǎo)致其第六段跨膜a-螺旋及后續(xù)的羧基端丟失,破壞其正常的沙漏結(jié)構(gòu)及其在細(xì)胞膜上的錨定。 結(jié)論 1、本研究首次報(bào)道了一個(gè)中國(guó)特殊表型(蝸牛殼樣)先天性白內(nèi)障

15、大家系，該家系的遺傳方式為常染色體顯性遺傳： 2、首次報(bào)道受體剪接位點(diǎn)突變引起的常染色體顯性遺傳性先天性白內(nèi)障。MIP基因第3號(hào)內(nèi)含子受體剪接位點(diǎn)突變(c．607-1G>A)與該先天性白內(nèi)障表型共分離，MIP為該先天性白內(nèi)障家系的疾病相關(guān)基因。 3、MIP基因3號(hào)內(nèi)含子隱性受體剪接位點(diǎn)激活后產(chǎn)生的異常剪接蛋白，將導(dǎo)致AQP0第六段跨膜a-螺旋及后續(xù)的羧基端丟失，破壞其正常的沙漏結(jié)構(gòu)及其在細(xì)胞膜上的錨定。 4、本實(shí)