幽門螺桿菌cagA基因在果蠅特定組織表達引起的表型變化及其對特定Wnt信號通路成員表達的影響.pdf

1、胃癌是世界上第四大惡性腫瘤，同時它也是第二位導致死亡的腫瘤，每年有超過70萬人死于胃癌。流行病學研究提示幽門螺桿菌在胃癌發(fā)生中起重要作用。幽門螺桿菌是革蘭氏陰性菌，螺旋狀。1984年被Warren和Marshall從人胃黏膜中分離并培養(yǎng)。按照是否存在細胞毒素相關(guān)基因A(cagA)，幽門螺桿菌可分為cagA陽性株和cagA陰性株。CagA蛋白通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)被注入細胞內(nèi)。移位后的CagA定植于漿膜的內(nèi)側(cè)面，并在此被Src激酶或Ab1激酶酪

2、氨酸磷酸化。CagA酪氨酸磷酸化的位點存在谷氨酸—脯氨酸—異亮氨酸—酪氨酸—丙氨酸(EPIYA)序列，該序列在CagA蛋白C末端重復出現(xiàn)。應用CagA轉(zhuǎn)基因小鼠證實CagA是作用于哺乳動物的細菌來源的癌蛋白，并且CagA酪氨酸磷酸化在幽門螺桿菌相關(guān)的腫瘤發(fā)生起重要作用。近來還有研究表明：CagA可通過磷酸化非依賴方式使β—catenin從細胞膜上移位到胞漿/胞核中，從而活化β—catenin信號。β—catenin既是粘附連接的重要組成

3、，同時也是Wnt信號通路的關(guān)鍵分子。而Wnt信號通路是在不同種屬間高度保守，在發(fā)育和腫瘤發(fā)生中都起著重要作用。Wnt信號通路成員APC或Axin基因的突變可導致結(jié)直腸癌，胰腺癌和肝細胞癌的發(fā)生。但Wnt信號通路與胃癌的發(fā)生是否相關(guān)尚不清楚，而CagA作為胃癌發(fā)生的重要因素之一，是否會影響到Wnt信號通路的活化也有待研究。 目的：本研究利用cagA轉(zhuǎn)基因果蠅，研究其通過GAL4—UAS系統(tǒng)在果蠅復眼與翅膀表達時表型變化情況，并且進

4、一步研究了CagA對Wnt信號通路中Wingless、Armadillo(β—catenin的果蠅同系物)和APC表達的影響情況。 方法：1.pUAST—cagA—HA質(zhì)粒的構(gòu)建。從pSP65SRα—cagA—HA質(zhì)粒中PCR擴增得到cagA—HA片段(兩端加有BamHI和XhoI酶切位點)，經(jīng)BamHI和XhoI酶切后構(gòu)建于pUSAT載體上。構(gòu)建后的質(zhì)粒在大腸桿菌DH5α中克隆擴增后經(jīng)EcoRI單酶切及BamHI/XhoI雙酶

5、切檢測是否構(gòu)建成功，通過測序檢測其基因序列是否正確。2.cagA轉(zhuǎn)基因的果蠅的制備過程。在蘋果培養(yǎng)基平板上收集在30分鐘內(nèi)yw果蠅所產(chǎn)的卵，浸于NaClO溶液中脫殼處理后，蒸餾水洗凈，將卵頭尾一致整齊排列，放入硅膠盒中干燥5—10分鐘，礦物油覆蓋。在倒置顯微鏡下從卵尾側(cè)注射制備好的質(zhì)粒。由于個人技術(shù)原因，經(jīng)過3個月的制備未成功獲得轉(zhuǎn)基因果蠅，美國奧勒岡大學分子生物學學院Karen Guilemin教授贈送cagA轉(zhuǎn)基因果蠅(yw；；UA

6、S—HA—cagA)。本文實驗所用cagA轉(zhuǎn)基因果蠅皆為此品系果蠅。3.復眼及翅膀中表達CagA果蠅的制備。將UAS—HA—cagA轉(zhuǎn)基因果蠅品系與眼原細胞特異表達的GMR—GAL4及在翅膀中特異表達的MS1096—GAL4品系果蠅雜交，誘導cagA在果蠅復眼與翅膀中表達，同時將yw果蠅品系與GMR—GAL4及MS1096—GAL4品系果蠅雜交做為對照。將以上果蠅放置25℃恒溫培養(yǎng)約10天后產(chǎn)生F1代，在體視顯微鏡下觀察子代F1代的復眼

7、與翅膀表型，UAS—HA—cagA轉(zhuǎn)基因果蠅與GMR—GAL4交配果蠅所得F1代進行自交配，觀察其F2代果蠅表型情況。4.表達CagA蛋白果蠅的胚胎的制備及應用免疫熒光染色方法檢測wingless、APC及Armadillo的表達。收取Arm—GAL4(Arm啟動子在胚胎廣泛表達)與UAS—HA—cagA交配果蠅的F1代雄性果蠅與UAS—HA—cagA處女果蠅交配，將所得果蠅卵蒸餾水沖洗，NaClO去除卵殼處理后，庚烷—甲醛混合液固定3

8、0分鐘，經(jīng)甲醇處理后，加一抗(兔抗EAPC，小鼠抗Armdillo，大鼠抗HA，小鼠抗Wingless)，4℃搖床孵育過夜(12—14h)。而后BBT溶液清洗，加入二抗Alexa goat488 anti—rabbit，546 anti—mouse，647anti—rat，室溫孵育2h。BBT溶液清洗。熒光封片劑封片，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并進行圖像采集。 結(jié)果：1、pUAST—cagA—HA質(zhì)粒構(gòu)建成功。酶切結(jié)果表明質(zhì)粒構(gòu)

9、建成功。利用測序引物進行測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行Blast，結(jié)果與幽門螺桿菌NCTC11637株cagA(AF202973)基因完全吻合。2、CagA在果蠅復眼與翅膀表達誘導產(chǎn)生的表型變化。GMR—GAL4果蠅與UAS—HA—cagA果蠅交配，F(xiàn)1代果蠅均出現(xiàn)輕度糙眼突變。F2代出現(xiàn)重度糙眼突變果蠅。MS1096—GAL4果蠅與UAS—HA—cagA果蠅交配。F1代出現(xiàn)彎翅突變。3.CagA在果蠅胚胎表達時wingless、A

10、PC及Armadillo的表達無變化。Arm—GAL4為可在胚胎廣泛表達的啟動子，UAS—HA—cagA在其作用下，可在胚胎廣泛表達。Wingless在CagA表達的胚胎中，其表達與對照組相比無變化。與之類似，在CagA表達的同時，APC和Armadillo的表達也未見變化。 結(jié)論：1、應用GAL4—UAS表達系統(tǒng)證實cagA基因的表達可影響果蠅復眼及翅膀的發(fā)育，導致果蠅糙眼突變及彎翅突變。2、EPIYA A—B—C—C型Cag