幽門螺桿菌對(duì)胃上皮細(xì)胞Toll樣受體信號(hào)通路影響的研究.pdf

1、研究目的：探討幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)對(duì)胃上皮Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)信號(hào)通路的影響及其在Hp致病中的作用，以闡明胃黏膜對(duì)Hp的識(shí)別和引起炎癥反應(yīng)的機(jī)制，為下一步通過(guò)調(diào)節(jié)TLRs信號(hào)通路來(lái)防治Hp感染及其相關(guān)性疾病的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為Hp相關(guān)性疾病的防治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法： (1)TLR4信號(hào)通路在Hp感染胃黏膜中的變化的研究：①采

2、用SP免疫組化方法檢測(cè)了189例胃鏡活檢的胃黏膜內(nèi)TLR4的表達(dá)。其中慢性非萎縮性胃炎(CNAG)75例(Hp陽(yáng)性50例，Hp陰性25例)，慢性萎縮性胃炎(CAG)24例(Hp陽(yáng)性13例，Hp陰性11例)，腸化與異型增生(IM+DYS)90例(Hp陽(yáng)性45例，Hp陰性45例)，另取組織學(xué)大致正常且Hp陰性胃黏膜20例做正常對(duì)照。②30只清潔級(jí)Balb/C小鼠分為：正常對(duì)照組；Hp感染組：建立Hp感染模型后不給予任何治療；Hp根除組：建立

3、Hp感染模型后，給予洛賽克0.06mg/次/只，羥氨芐青霉素2.9mg/次/只，殼聚糖12.5mg/次/只。每日2次，共2周。未次給藥后4周處死小鼠取胃黏膜，采用細(xì)菌培養(yǎng)和Geimsa染色檢測(cè)Hp感染，用RT-PCR和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃黏膜內(nèi)TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)。 (2)Hp對(duì)人正常胃上皮細(xì)胞株GES-1內(nèi)TLRs信號(hào)通路的影響：①分別以Hp培養(yǎng)上清和活菌作用正常胃上皮細(xì)胞GES-1，分為下幾組：實(shí)驗(yàn)組A為不同濃度H

4、p培養(yǎng)上清(0.630μg/μl、0.315μg/μl、0.158μg/μl、0.079μg/μl)作用組，每組分別觀察24h、48h和72h；實(shí)驗(yàn)組B為不同濃度Hp活菌(4.00×107CFU/ml、2.00×107CFU/ml、1.00×107CFU/ml、0.50×107CFU/ml)作用組，每組分別觀察16h、24h、48h；另以僅加入Hp空白液體培養(yǎng)基為對(duì)照組。②用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。③用RT-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)

5、胞TLR2、TLR4和MyD88mRNA的表達(dá)。 研究結(jié)果： (1)TLR4信號(hào)通路在Hp感染胃黏膜中的變化的研究：①在各組疾病中無(wú)論是在上皮細(xì)胞還是炎性細(xì)胞Hp感染者胃黏膜內(nèi)TLR4的表達(dá)顯著高于無(wú)Hp感染者(P<0.05～0.001)；②在Hp感染者中CagA陽(yáng)性菌株感染者胃黏膜上皮和炎細(xì)胞內(nèi)TLR4的表達(dá)均顯著高于Hp陰性者和CagA陰性菌株感染者(P<0.01～0.001)，在炎細(xì)胞內(nèi)CagA陰性菌株感染者TLR

6、4表達(dá)高于Hp陰性者(P<0.05)，而在上皮細(xì)胞內(nèi)TLR4表達(dá)的CagA陰性菌株感染者與Hp陰性者無(wú)差異(P>0.05)；③在小鼠Hp感染模型中Hp感染小鼠胃上皮細(xì)胞TLR4蛋白和mRNA表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，而給予Hp根除后小鼠TLR4的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，與正常對(duì)照組無(wú)差別(P>0.05)。 (2)Hp對(duì)人正常胃上皮細(xì)胞株GES-1內(nèi)TLRs信號(hào)通路的影響： 1)在Hp培養(yǎng)上清作用各實(shí)

7、驗(yàn)組的生長(zhǎng)抑制率顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，并且隨著濃度的增加對(duì)GES-1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用增加，在各時(shí)間段0.6301μg/μl組的生長(zhǎng)抑制率顯著高于其它各濃度組(P<0.001)；在24h時(shí)0.315μg/μl組顯著高于0.079μg/μl組(P<0.01)；在48h和72h時(shí)0.315μg/μl和0.158μgμl濃度組顯著高于0.079μg/μl組(P<0.001～0.01)；在72h時(shí)0.158μg/μl組顯著高于0.0

8、79μg/μl組(P<0.01)。 2)Hp培養(yǎng)上清作用時(shí)間對(duì)GES-1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的顯著影響，在0.315μg/μl、0.158μg/μl和0.079μg/μl濃度范圍內(nèi)Hp培養(yǎng)上清作用時(shí)間對(duì)GES-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制有顯著差異(P<0.001～0.05)。在0.315μg/μl和0.158μg/μl濃度時(shí)48h和72h組的抑制作用均顯著高于24h組(P<0.001～0.01)，以48h最強(qiáng)；在0.079μg/μl濃度時(shí)48h

9、組的抑制作用顯著高于24h組(P<0.01)；在各濃度時(shí)48h和72h組之間無(wú)差異，表明在48h時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用已達(dá)高峰。在高濃度時(shí)(0.630μg/μl)各時(shí)間段的生長(zhǎng)抑制作用無(wú)差異(P>0.05)。 3)在Hp活菌作用各實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)抑制率顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，并且隨著細(xì)菌濃度的增加GES-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率增加，在16h和24h時(shí)4×107CFU/ml組的生長(zhǎng)抑制率顯著高于其它各濃度組(P<0.001)，2×

10、107CFU/ml組顯著高于0.5x107CFU/ml組(P<0.01)；在48h時(shí)各濃度之間均的顯著差異(P<0.001-0.05)。 4)Hp活菌作用時(shí)間對(duì)GES-1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的顯著影響，隨著Hp作用時(shí)間延長(zhǎng)生長(zhǎng)抑制率增加，在所有濃度時(shí)16h組的抑制率均顯著低于24h和48h組(P<0.001～0.01)，在2×107CFU/ml和1×107CFU/ml的濃度范圍內(nèi)24h組的生長(zhǎng)抑制率還顯著低于48h組(P<0.01～0

11、.05)。 5)不同濃度Hp培養(yǎng)上清對(duì)GES-1細(xì)胞內(nèi)TLR4 mRNA的表達(dá)有顯著差異(P<0.001～0.05)，在各時(shí)間段以0.315μg/μl和0.158μg/μl組TLR4的表達(dá)最高，均顯著高于對(duì)照組和0.630μg/μl組(P<0.05～0.001)，在48h和72h時(shí)還顯著高于0.079μg/μl組(P<0.001～0.01)，在24h時(shí)0.158μg/μl組TLR4的表達(dá)也顯著高于0.630μg/μl組(P<0.

12、05)，在48h時(shí)0.079μg/μl組TLR4的表達(dá)也顯著高于0.630μg/μl組(P<0.05)；但不同作用時(shí)間組GES-1細(xì)胞內(nèi)TLR4mRNA的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。 6)不同濃度Hp活菌對(duì)GES-1細(xì)胞內(nèi)TLR4mRNA的表達(dá)有顯著差異(P<0.001～0.05)，在各時(shí)間段4×107CFU/ml、2×107CFU/ml和1×107CFU/ml組均顯著高于對(duì)照組(P<0.001～0.05)，在16h時(shí)2×1

13、07CFU/ml組還顯著高于1×107CFU/ml和0.5×107CFU/ml組(P<0.05)，在24h時(shí)0.5×107CFU/ml組也顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，在48h時(shí)4×107CFU/ml和2×107CFU/ml組還顯著高于0.5×107CFU/ml組(P<0.05)；但不同作用時(shí)間組GES-1細(xì)胞內(nèi)TLR4mRNA的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。 7)不同濃度Hp培養(yǎng)上清對(duì)GES-1細(xì)胞內(nèi)TLR2mRNA的表達(dá)

14、有顯著差異(P<0.001)，在各時(shí)間段以0.315μg/μl和0.158μg/μl組TLR2的表達(dá)最高，均顯著高于對(duì)照組、0.630μg/μl組和0.079μg/μl組(P<0.001)；但不同作用時(shí)間組GES-1細(xì)胞內(nèi)TLR2mRNA的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。 8)不同濃度Hp活菌對(duì)GES-1細(xì)胞內(nèi)TLR2mRNA的表達(dá)有顯著差異(P<0.001～0.05)，在各時(shí)間段4×107CFU/ml、2×107CFU/ml和

15、1×107CFU/ml組TLR2的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.001～0.05)，4×107CFU/ml組還顯著高于0.5×107CFU/ml組(P<0.01～0.05)，在48h時(shí)2×107CFU/ml組顯著高于0.5×107CFU/ml組(P<0.01)；但不同作用時(shí)間組GES-1細(xì)胞內(nèi)TLR2mRNA的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。 9)不同濃度Hp培養(yǎng)上清對(duì)GES-1細(xì)胞內(nèi)MyD88mRNA的表達(dá)有顯著差異(P<0.

16、05)，在24h時(shí)0.630μg/μl和0.315μg/μl組MyD88的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組和0.079μg/μl組(P<0.01～0.05)；在48h時(shí)0.630μg/μl組MyD88的表達(dá)顯著高于對(duì)照組、0.315μg/μl和0.158μg/μl組(P<0.01)；在0.158μg/μl濃度時(shí)48h組顯著高于24h組(P<0.01)其它各濃度時(shí)不同作用時(shí)間組GES-1細(xì)胞內(nèi)MyD88mRNA的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

17、 10)不同濃度Hp活菌對(duì)GES-1細(xì)胞內(nèi)MyD88mRNA的表達(dá)有顯著差異。 11)Hp培養(yǎng)上清作用組TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)之間有顯著相關(guān)性(P<0.001～0.01)：但二者與MyD88之間無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。 結(jié)論： (1)Hp感染患者和小鼠胃黏膜內(nèi)TLR4表達(dá)均顯著上調(diào)，而Hp根除后TLR4表達(dá)下降，提示Hp可上調(diào)TLR4的表達(dá)，其可能通過(guò)TLR4信號(hào)通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。 (2)H