幽門螺桿菌CagA與YWHAE相互作用對(duì)細(xì)胞遷移的影響.pdf

1、目的：
　　細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(CagA)是幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）的重要毒力因子，與胃腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。本研究在已證實(shí)CagA與胃黏膜上皮細(xì)胞YWHAE蛋白具有相互作用的前提下，應(yīng)用cagA野生株與缺失突變株的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證CagA對(duì)細(xì)胞功能的影響，進(jìn)而在此基礎(chǔ)上探討CagA與YWHAE相互作用對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞遷移的影響，旨在進(jìn)一步闡明Hp CagA的致病機(jī)制。
　　方法：
　　1

2、.CagA及YWHAE在細(xì)胞定位上的驗(yàn)證：通過(guò)Hp NCTC11637標(biāo)準(zhǔn)株感染AGS細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞后，分別采用CagA及YWHAE的特異性抗體處理細(xì)胞，用激光共聚焦顯微鏡觀察CagA和YWHAE在細(xì)胞中的定位。
　　2.構(gòu)建NCTC11637 cagA基因缺失株NCTC11637ΔcagA：采用基因敲除同源重組原理，構(gòu)建帶卡那霉素抗性標(biāo)志的cagA缺失突變質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化到NCTC11637標(biāo)準(zhǔn)株中，用卡那霉素篩選出NC

3、TC11637ΔcagA，用PCR和Western blot技術(shù)鑒定cagA基因的缺失及CagA蛋白的表達(dá)情況，將NCTC11637△cagA連續(xù)傳25代進(jìn)行cagA基因缺失遺傳穩(wěn)定性的鑒定。
　　3.NCTC11637 CagA對(duì)SGC7901細(xì)胞生物學(xué)功能的影響：將NCTC11637和NCTC11637ΔcagA以MOI(Bacterium/Cell)=100分別感染SGC7901細(xì)胞，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：Hp感染細(xì)胞5天，每天用M

4、TS法檢測(cè)細(xì)胞的增殖，細(xì)胞增殖率=OD2-5d/OD1d； Hp感染細(xì)胞48h，用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期；劃痕劃線法檢測(cè)細(xì)胞遷移情況：Hp感染細(xì)胞6h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行劃痕劃線處理，用Carl Zeiss License Activation Tool對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照測(cè)量劃痕寬距，48h后觀察細(xì)胞遷移情況，細(xì)胞遷移距離=6h劃痕寬距-48h劃痕寬距。
　　4.構(gòu)建YWHAE過(guò)表達(dá)及沉默的AGS細(xì)胞及SGC7901細(xì)胞：將本

5、實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的YWHAE真核表達(dá)質(zhì)粒pCMVTNT-YWHAE及YWHAE siRNA分別通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000及X-tremeGENE siRNA transfection reagent轉(zhuǎn)染AGS及SGC7901細(xì)胞，48h后分別進(jìn)行Western blot驗(yàn)證YWHAE蛋白的表達(dá)情況及YWHAE siRNA的干擾效果。
　　5.CagA和YWHAE的相互作用對(duì)細(xì)胞遷移功能的影響：將本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的

6、CagA真核表達(dá)質(zhì)粒pCMVTNT-cagA，通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染AGS及SGC7901細(xì)胞，48h后進(jìn)行Western blot的驗(yàn)證；用不同濃度的pCMVTNT-cagA及pCMVTNT-YWHAE分別轉(zhuǎn)染AGS及SGC7901細(xì)胞，采用劃痕劃線法檢測(cè)細(xì)胞的遷移情況；選擇適當(dāng)濃度的pCMVTNT-cagA及 pCMVTNT-YWHAE（或YWHAEsiRNA）共轉(zhuǎn)染AGS和SGC7901細(xì)胞，同法檢測(cè)細(xì)

7、胞遷移情況。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS20.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、析因設(shè)計(jì)方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)細(xì)胞免疫熒光共定位，可以在AGS細(xì)胞及SGC7901細(xì)胞的胞漿中觀察到CagA與YWHAE同時(shí)存在，表明了CagA與YWHAE能共定位于AGS細(xì)胞及SGC7901細(xì)胞漿中。
　　2.經(jīng)PCR、Western blot鑒定成功構(gòu)建了NCTC11637 cagA基因缺失株，

8、并經(jīng)連續(xù)傳25代，證明獲得了可穩(wěn)定遺傳的NCTC11637ΔcagA。
　　3. NCTC11637 CagA對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能影響的驗(yàn)證
　　（1）細(xì)胞增殖方面：細(xì)胞培養(yǎng)至第3-5天，NCTC11637組細(xì)胞增殖速率大于NCTC11637ΔcagA組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，第3天及第5天有顯著性差異（P<0.05）；
　?。?）細(xì)胞凋亡方面：細(xì)胞凋亡率NCTC11637組（1.82％）較NCTC11637ΔcagA組（2.55

9、%）低（P<0.01）；
　?。?）細(xì)胞周期方面：NCTC11637組 G1期、S期、G2期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為60.77%、25.4%、13.04%，NCTC11637ΔcagA組G1期、S期、G2期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為56.78%、28.27%、13.95%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間在各期內(nèi)比較有顯著性差異（P<0.05）；
　?。?）細(xì)胞遷移方面：NCTC11637組細(xì)胞遷移距離（147.39μm）較NCTC11637ΔcagA組

10、細(xì)胞遷移距離（81.65μm）大（P<0.05）。
　　4.構(gòu)建YWHAE過(guò)表達(dá)及沉默的AGS及SGC7901細(xì)胞
　　通過(guò)Western bolt驗(yàn)證，AGS及 SGC790細(xì)胞中YWHAE蛋白的表達(dá)量：pCMVTNT-YWHAE組高于陰性對(duì)照pCMV-TNT組，YWHAE siRNA組低于陰性對(duì)照無(wú)關(guān)siRNA組（NC組）。
　　5.CagA與YWHAE的相互作用對(duì)細(xì)胞遷移的影響
　　（1）通過(guò)Western

11、 bolt驗(yàn)證，在AGS及SGC790細(xì)胞中CagA蛋白的表達(dá)量：pCMVTNT-cagA組高于陰性對(duì)照pCMV-TNT組。
　?。?）在AGS及SGC7901細(xì)胞中均可觀察到：
　　a.隨著pCMVTNT-cagA濃度的增高，細(xì)胞遷移距離逐漸增加；而隨著pCMVTNT-YWHAE濃度的增高，細(xì)胞遷移距離逐漸減少；
　　b.共轉(zhuǎn)pCMVTNT-cagA、pCMVTNT-YWHAE后：細(xì)胞遷移距離CMV-YWAHE

12、VTNT　　c.共轉(zhuǎn)pCMVTNT-cagA、YWHAE siRNA后：細(xì)胞遷移距離CMV-YWAHE+NC　　結(jié)論：
　　1.空間定位證明CagA和YWHAE可在細(xì)胞內(nèi)相互作用。
　　2.N