幽門螺桿菌cagA轉基因小鼠胃病理表型與分析.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的發(fā)現(xiàn)是20世紀胃腸病學領域的一大重要事件?，F(xiàn)已明確H.pylori是慢性胃炎、胃和十二指腸消化性潰瘍、胃腺癌和胃粘膜相關淋巴樣組織淋巴瘤的主要病因。1994年世界衛(wèi)生組織將其歸為Ι類致癌因子。H.pylori的毒力致病因子主要包括:尿素酶、鞭毛、黏附素、脂多糖、空泡毒素及細胞毒素相關蛋白CagA等。通常以H.pylori是否表達VacA和CagA毒力蛋白進行分型,其

2、中I型H.pylori具有典型的以cagA為標志的細菌致病島(cag pathogenicity island),稱其為cagPAI。在大量的研究中證明,是否含有cagPAI是H.pylori具有較強毒力的重要標示,同時在H.pylori的致病過程中cagPAI也起到了重要的作用。
　　CagA蛋白具有多態(tài)性,其C端的EPIYA基序在來自東亞型和西方型的H.pylori中有明顯的不同。細胞實驗表明,西方型和東亞型H.pylori的

3、CagA蛋白其致病能力不同。但由于H.pylori具有多種致病因子,長期感染H.pylori的動物模型并不能演示單一CagA蛋白的致病作用。而cagA轉染AGS細胞雖可揭示CagA的致病機制,并避免H.pylori其他致病因子的影響,但并不能準確模擬H.pylori在體內的致病過程。
　　基于以上原因,本課題組成功建立了東亞型(cagA-9810,羧基端含有EPIYA-ABD基序)和西方型(cagA-Ca52,羧基端含有EPIYA

4、-ABC基序)2個品系的轉基因小鼠模型。本課題在此工作基礎上進行了如下三個方面的研究:
　　1.在DNA水平進行了cagA基因整合拷貝數與完整性檢測
　　為了確保CagA蛋白在cagA轉基因小鼠體內進行有效表達,在得到cagA-9810和cagA-Ca52二個品系轉基因小鼠子代后,我們首先對2個品系4個亞系小鼠染色體上所插入的cagA片段的拷貝數進行了檢測,結果表明cagA-Ca52品系的AC155亞系、GC996亞系和ca

5、gA-9810品系的YB081亞系、YB053亞系小鼠基因組所插入的cagA基因片段拷貝數分別為5、8、6、6拷貝。其次我們檢測了轉基因小鼠插入cagA基因片段的完整性,分別在cagA基因5’端和3’端靶序列區(qū)域設計PCR引物并進行PCR擴增,在所有品系和亞系的小鼠均檢測到了陽性擴增條帶,且測序正確。
　　2.進行了小鼠體內CagA表達水平檢測
　　在經過DNA水平檢測后,我們在RNA水平對cagA基因的轉錄情況進行了檢測。

6、提取小鼠胃組織RNA,進行RT-PCR,結果表明cagA轉基因陽性小鼠可以進行cagA基因轉錄,且擴增產物測序結果正確。以CagA蛋白及其C端連接的HA標簽為靶標進行了Western-Blot檢測。結果表明CagA蛋白在cagA轉基因陽性小鼠體內獲得了表達。
　　3.CagA表達陽性小鼠胃病理表型分析
　　我們針對6-18月齡的cagA-Ca52和cagA-9810品系共148只小鼠進行了病理解剖學和病理組織學觀察,其中ca

7、gA-Ca52陽性小鼠57只,cagA-9810陽性小鼠59只,同窩陰性對照小鼠32只。結果表明:CagA表達陽性小鼠的胃部發(fā)生的了明顯的炎癥、息肉樣增生、腺瘤樣增生及腸化生等病變,其中息肉樣增生、腺瘤樣增生及腸化生可列為癌前病變。以Ki-67抗體進行免疫組化染色分析,發(fā)現(xiàn)在部分病變小鼠胃粘膜腺頸部、胃小凹、胃底腺出現(xiàn)了細胞核深染,細胞增殖旺盛的現(xiàn)象。經阿爾新藍染色發(fā)現(xiàn)部分小鼠胃底腺出現(xiàn)肥大粘液細胞。統(tǒng)計表明,東亞型cagA轉基因小鼠發(fā)

8、生癌前病變比例為51％,西方型轉基因小鼠發(fā)生癌前病變比例為28%。兩個品系的轉基因小鼠在觀察期限內胃部及十二指腸都沒有發(fā)現(xiàn)明確的癌癥病灶,但是CagA表達陽性小鼠發(fā)生疾病的比例要遠高于同籠陰性對照組小鼠,且觀察到了癌前病變。
　　總之,在獲得了東亞型cagA轉基因小鼠cagA-9810(EPIYA-ABD)和西方型轉基因小鼠cagA-Ca52(EPIYA-ABC)后,經過對轉基因小鼠DNA、RNA及蛋白水平的檢測,以及病理學、病理