共培養(yǎng)誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向leydig細胞分化的研究.pdf

1、研究背景
　　 隨著環(huán)境污染、人口老齡化的日益加重，雄激素缺乏性疾病的發(fā)病率具有逐年上升的趨勢，雄激素的缺乏不但嚴重影響患者身體健康如男性第二性征異常、造成生理功能紊亂，且嚴重影響男性的心理健康，容易造成社會問題[1、2]。
　　 針對這類疾病，傳統(tǒng)上的治療主要靠外源性的雄性激素補充或替代，但由于外源性雄激素補充無法接受垂體-性腺軸的生理調(diào)節(jié)，易造成體內(nèi)激素失調(diào)失調(diào)，且抑制體內(nèi)的正常雄性激素的分泌，長期使用常會引起高血壓

2、、紅細胞增多、骨密度異常等一系列嚴重并發(fā)癥[2]。與之相比，Leydig細胞移植，可接受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)，符合人的生理規(guī)律，具有明顯優(yōu)勢，是治療雄激素缺乏性疾病的可靠、理想的治療途徑[5]。隨著組織工程技術的發(fā)展，采用組織工程技術以Leydig細胞作為種子細胞，重建具有正常生理功能和形態(tài)的組織，則有望在形態(tài)、功能兩個方面解決睪丸缺失/雄激素缺乏性疾病，為該類疾病的治療提供更符合生理的治療途徑[4]。
　　 雖然Leyd

3、ig細胞治療具有明顯的優(yōu)勢，但細胞來源不足和免疫排斥問題是制約該技術發(fā)展的主要瓶頸。Leydig細胞僅存于睪丸，數(shù)量有限（僅占睪丸細胞總量的2-5％），普遍依靠同種異體供應，存在免疫排斥問題，臨床廣泛應用受到極大限制[5]。
　　 來源于自體骨髓組織或脂肪組織的間充質(zhì)干細胞，取材方便，通過體外分離、培養(yǎng)及富集，可獲得大量的細胞，如果能將其誘導成leydig細胞，則可以同時解決leydig細胞移植的來源及免疫排斥兩個問題。普遍認為

4、，性腺及腎上腺等類固醇合成器官從來源于中段中胚層的腎上腺生殖器原基發(fā)育而來[6]，而Leydig細胞來源于胚胎發(fā)育期的中腎胚的間質(zhì)細胞，并認為位于管周的成纖維樣細胞為leydig干細胞或前體細胞，leydig細胞由這些細胞分化而來[7]。間充質(zhì)干細胞（mesenchymAlStem Cells，MSCs）與leydig干細胞都來源于中胚層，因而具有向Leydig細胞轉化的理論可能[8]。普遍認為類固醇因子-1（steroidogenic

5、 factor 1， SF-1）是睪丸及腎上腺發(fā)育及類固醇激素合成的關鍵的核內(nèi)受體，在它的調(diào)控下，類固醇合成酶的各個基因得以表達[6]。Tomoko Tanaka在2006年用骨髓基質(zhì)細胞注入發(fā)育期的大鼠睪丸內(nèi)，這些細胞表現(xiàn)出與leydig細胞相似的特性；同時將攜帶綠色熒光蛋白的P450scc用腺病毒攜帶AD/4Bp基因后轉染體外分離小鼠BMSCs，并在加入cAMP培養(yǎng)液中培養(yǎng)2周后，這些細胞表現(xiàn)出leydig細胞的特性，并能分泌睪酮[

6、8]。Gondo等在2008年用這種方法處理BMSCs及脂肪干細胞（adipose-derived mesenchymAlstem cells， AMSCs）后，發(fā)現(xiàn)BMSCs向產(chǎn)生睪酮的leydig細胞方向分化，而AMSCs則傾向于產(chǎn)生糖皮質(zhì)類激素的腎上腺細胞分化[6]。Takashi2009年將肝受體同系物-1（liver receptor homolog-1，LRH）以質(zhì)粒轉染人的BMSCs及cAMP處理后，這些細胞表達腎上腺及睪

7、酮合成的基因[9]。該類實驗表明BMSCs在異位表達的SF-1的刺激下可以向leydig細胞方向轉化，轉錄并表達睪酮合成過程中所需的各種酶，并具有睪酮分泌功能。該類實驗主要用于研究性腺器官的發(fā)育，由于腺病毒轉染的潛在安全問題，誘導后的細胞在臨床治療中的意義不大，同時說明在誘導分化為leydig細胞上BMSCs比ADSCs更適合。
　　 另外的研究主要是利用leydig細胞在體內(nèi)生長的微環(huán)境在也可將BMSCs誘導向leydig細胞

8、方向分化。Takashi Yazawa及Tomoko Tanaka等將大鼠BMSCs注射入3周齡發(fā)育期大鼠睪丸，結果顯示注射的部分BMSCs能向Leydig細胞分化，并表達leydig細胞的各種細胞標志物[8、10]。YanHe Lue等進一步探討了BMSCs注射入睪丸的曲精小管及睪丸間質(zhì)的分化結局，綠色熒光蛋白標記的BMSCs分別注射入正常leydig細胞的大鼠及c-kit基因沉默的W/Wv大鼠（睪丸發(fā)育缺陷，無法形成精原細胞）睪丸內(nèi)

9、，10-12周后注射入正常大鼠的睪丸內(nèi)BMSCs根據(jù)鄰近細胞的情況，依次分化為與鄰近細胞相識的Leydig細胞、Sertoli細胞、生殖細胞系細胞等體細胞成分，而注射入睪丸發(fā)育畸形鼠體內(nèi)的BMSCs未發(fā)生分化。雖該然不能完全排除細胞融合的可能，但是可以說明睪丸各種細胞生長的微環(huán)境對移植BMSCs的定向分化具有誘導作用[11]。
　　 上述研究成果顯示BMSCs誘導分化成為Leydig細胞具有可行性，但距臨床應用仍有差距。基因轉染

10、技術雖然有望在體外大量的誘導BMSCs分化為雄激素分泌細胞，但該方法必須克服腺病毒轉染技術帶來的生物安全性問題，目前尚屬世界性難題。BMSCs睪丸內(nèi)注射屬實驗性研究，要求受體動物在發(fā)育期，對于Leydig細胞功能不足或不存在睪丸的受體意義不大，且分化的效率不高，目前通過該途徑很難獲得大量的自體BMSCs分化的Leydig細胞。然而，以上研究成果提示，雖然目前對睪丸分化微環(huán)境促進BMSCs定向分化的始動因素并不明確，但通過體外模擬Leyd

11、ig細胞生長的微環(huán)境，在體外實現(xiàn)BMSCs向Leydig細胞大量的定向分化具備理論可能性。
　　 綜上所述，針對Leydig細胞治療及雄激素分泌組織構建研究中關鍵的種子細胞來源問題，結合本課題組前期實驗中，通過差速貼壁法可以大量獲得較純的leydig細胞的基礎上，將骨髓間充質(zhì)干細胞與Leydig細胞共培養(yǎng)，利用leydig細胞生長的微環(huán)境及分泌的可溶性因子誘導BMSCs向Leydig細胞分化，以解決種子細胞來源不足的難題。該項研

12、究可為臨床雄性激素缺乏癥提供一條安全有效的途徑，同時對于進一步研究胚胎發(fā)育過程中l(wèi)eydig干細胞具體分化過程中的各種細胞因子的作用及調(diào)控機制具有借鑒意義。研究目的
　　 本研究從骨髓基質(zhì)干細胞開始，通過Ficoll液分離、貼壁、增殖并傳代，富集足夠的BMSCs，并經(jīng)過誘導分化成骨、成脂肪鑒定BMSC的多向分化能力；通過差速貼壁法獲得的大鼠睪丸leydig細胞的免疫組化分析，證實差速貼壁法可以獲得較純的大鼠睪丸leydig細胞；

13、探索共培養(yǎng)體系對BMSC向leydig細胞誘導的可能性，并對誘導后的BMSC進行l(wèi)eydig細胞的各項特異性指標進行免疫組化、RT-PCR的測定，檢驗誘導的BMSC作為雄激素分泌組織種子細胞的可行性，為解決組織工程化雄激素分泌組織研究中種子細胞來源不足的問題提供有效手段。
　　 研究方法
　　 一、 密度梯度離心法獲得骨髓基質(zhì)干細胞及鑒定：3周齡大鼠的股骨、脛骨，10ml注射器沖洗，1.083g/ml的ficoll去除血

14、細胞，2天后半量換液，4天后首次全部換液，獲取的貼壁細胞，并傳代培養(yǎng)。取第三代BMSC進行成骨、成脂肪分化誘導。同時觀察細胞形態(tài)，克隆樣集落形成，并檢測細胞增殖情況。
　　 二、
　　 差速貼壁法分離純化3周鼠齡大鼠Leydig細胞：取3周齡雄性Wister大鼠雙側睪丸，無菌下去除白膜及較大的血管，用膠原酶震蕩消化和400目（Ф33μm）不銹鋼濾網(wǎng)過濾，離心后貼壁培養(yǎng)2小時，棄上清并漂洗3次，加入3％FBS的DMEM/F

15、12培養(yǎng)液培養(yǎng)。
　　 三、
　　 共培養(yǎng)體系對BMSC誘導分化作用：3周齡大鼠睪丸leydig分離后以transwell培養(yǎng)皿雙層間接共培養(yǎng)體系進行培養(yǎng)，隔1-2天換液，2周、4周后對誘導的細胞 3β-HSD、LHR免疫化學染色、免疫熒光染色，PCR檢測stAR、3β-HSD及LHR的表達情況及睪酮分泌水平的測定。
　　 研究結論
　　 本研究證實差速貼壁法能夠有效獲得大鼠睪丸Leydig系細胞的各級細