傳染性法氏囊病病毒流行株的分離與檢測方法的建立.pdf

1、傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的雛雞傳染病，IBDV感染雛雞后引起法氏囊萎縮，最終導(dǎo)致死亡。給世界商業(yè)化養(yǎng)雞行業(yè)造成巨大損失。因此對IBD的流行病學(xué)調(diào)查及研制快速、準(zhǔn)確的IBDV檢測方法至關(guān)重要。本研究對華東區(qū)域傳染性法氏囊病病毒流行株進(jìn)行分離及生物學(xué)性狀分析，結(jié)合單克隆抗體技術(shù)建立了IBDV雙抗體夾心ELISA和膠體金試紙條檢測方法，為今后IBD的綜合防治提供幫助。
　　試驗一:華東區(qū)域傳染性法氏

2、囊病病毒流行株的分離及其生物學(xué)特性分析
　　為了解華東區(qū)域近年來IBDV的遺傳變異現(xiàn)狀，從該地區(qū)近三年來IBD疫苗免疫失敗雞群中分離到7株IBDV，命名為J3、A4、S8、S9、A11、S14和J17。7株IBDV均能直接適應(yīng)于雞胚培養(yǎng)，但對CEF、DF-1以及DF-EGFP-miR-9三種細(xì)胞的適應(yīng)性和細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒滴度有顯著差異，較易適應(yīng)于DF-EGFP-miR-9細(xì)胞，A11毒株在DF-EGFP-miR-9細(xì)胞中的滴度高達(dá)

3、1011TCID50/0.1ml。用第3代雞胚毒分別感染6周齡SPF雛雞，均表現(xiàn)出臨床癥狀和死亡，發(fā)病率為100％,死亡率在50％～70％，而用第20代細(xì)胞毒感染的SPF雛雞，均未出現(xiàn)臨床癥狀和死亡。將7株IBDV分離毒vp2基因全長序列進(jìn)行同源性分析，核苷酸和編碼氨基酸序列的同源性分別為97.4％～99.6％和98.7％～99.8％。遺傳進(jìn)化分析，7株IBDV分離毒均屬于血清Ⅰ型，分布在三個相對獨立的超強毒力IBDV(vvIBDV)分

4、枝中，特征性氨基酸位點表現(xiàn)出IBDV強毒株特性。在vp2第一親水區(qū)，J17毒株有212N，S14毒株有222L，不同于其它強毒株或弱毒株。本研究結(jié)果表明，近年來，在華東區(qū)域IBD免疫失敗的雞群中流行著超強毒力vvIBDV，毒株的生物學(xué)特性有明顯差異，毒株的來源比較復(fù)雜，IBD的防控面臨著新挑戰(zhàn)。
　　試驗二:分泌傳染性法氏囊病病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立
　　分別用純化的傳染性法氏囊病病毒和昆蟲細(xì)胞表達(dá)的重組VP2蛋白免

5、疫BALB/c小鼠，利用單克隆抗體技術(shù)，制備脾細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過篩選和克隆化，獲得2株能穩(wěn)定分泌傳染性法氏囊病病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為4G8和2C9，抗體亞類分別為IgG2a和IgM。間接ELISA檢測表明，2株單克隆抗體均只與IBDV VP2蛋白反應(yīng)，而與其他4種禽類病毒及CEF細(xì)胞均無交叉反應(yīng)，腹水效價分別為107和108。間接免疫熒光試驗(IFA)證明，2株單抗均與傳染性法氏囊病病毒細(xì)胞適應(yīng)毒和

6、重組VP2蛋白發(fā)生特異性反應(yīng);western blot分析表明，只有4G8能特異性識別傳染性法氏囊病病毒和重組VP2蛋白的線性表位;病毒中和實驗分析表明，單抗4G8腹水中和效價為107，單抗2C9無中和活性。
　　試驗三:傳染性法氏囊病病毒單克隆抗體夾心ELISA檢測方法的建立
　　本實驗以mAb-2C9為捕獲抗體，以HRP-4G8為標(biāo)記抗體，經(jīng)過條件優(yōu)化，建立檢測傳染性法氏囊病病毒的單克隆抗體夾心ELISA方法。特異性試驗

7、證明，單克隆抗體夾心ELISA方法與實驗室保存的四種禽病毒(NDV、AIV H9N2、IBV、EDSV)、CEF細(xì)胞和正常SPF雞組織均無交叉反應(yīng);敏感性實驗表明，應(yīng)用所建立的方法對傳染性法氏囊病病毒細(xì)胞適應(yīng)毒的最低檢出量為102.8TCID50;重復(fù)性試驗表明，夾心ELISA方法同一批次內(nèi)及不同批次間檢測相同樣品的變異系數(shù)均小于10％。實驗結(jié)果表明，所建立的夾心ELISA方法特異性好、敏感性高、與其他方法符合率高，可用于傳染性法氏囊病

8、的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
　　試驗四:傳染性法氏囊病病毒單克隆抗體膠體金免疫層析檢測試紙條的制備
　　用mAb-4G8作為金標(biāo)記抗體，mAb-2C9作為檢測抗體，根據(jù)建立的夾心ELISA方法制備傳染性法氏囊病病毒單克隆抗體膠體金免疫層析檢測試紙條。經(jīng)過比較優(yōu)化，確定膠體金溶液最適顆粒直徑大小為20～30nm，最適pH為8.0，最適mAb-4G8工作濃度為18μg/mL，mAb-2C9最佳包被濃度為1.5mg/mL，質(zhì)控抗體