傳染性法氏囊病病毒VP5缺失減毒株的構(gòu)建.pdf

1、傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性接觸性傳染病，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。IBDV主要侵害3-8周齡雛雞的中樞免疫器官法氏囊，破壞帶有sIgM的B淋巴細胞，引起脾臟、胸腺及外周血液淋巴細胞的凋亡，導(dǎo)致以淋巴細胞衰竭壞死為主要特征的免疫缺陷性和免疫抑制性疾病。 通過易感動物雛雞，構(gòu)建了一株傳染性法氏囊病病毒基因組節(jié)段雜合病毒。應(yīng)用PCR定點突變方法，在IBDV野毒株ZJ2000株A節(jié)段23

2、66-2371nt引入沉默突變NaeI后，克隆入真核表達載體pCI，獲得pCI-AKZJ2000，分別制備pCI-AKZJ2000、以及含有細胞致弱疫苗株HZ2株A和B節(jié)段全長的真核表達載體pCI-AKHZ2和pCI-mBHZ2的超純質(zhì)粒。不同組合的上述質(zhì)粒(pCI-AKZJ2000/pCI-mBHZ2和pCI-AKHZ2/pCI-mBHZ2)，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，肌肉途徑分別注射雛雞。通過血清抗體、病毒抗原和病毒粒子檢測、雞胚傳代試驗、以

3、及分子遺傳標記鑒定，表明從雞體內(nèi)拯救出了雜合病毒rAKZJ/HZ和重組病毒Xihu2002株。本試驗為IBDV的反向遺傳系統(tǒng)提供了一個新策略，尤其是對于不能適應(yīng)細胞的IBDV強毒株的拯救。結(jié)果還提示IBDV基因組B節(jié)段序列對病毒毒力具有重要作用，為研究VP1蛋白在病毒復(fù)制和致病中的作用提供了思路。制備了兔抗IBDVVP5多克隆抗體。利用RT-PCR技術(shù)從IBDV地方分離株TL2004株感染雞胚尿囊液中擴增到VP5基因，進而構(gòu)建了T7啟動

4、子控制下的N端GST-Tag融合表達質(zhì)粒pGEX-VP5。序列測定表明VP5基因全長438bp，編碼一個由145個氨基酸組成的VP5蛋白。將pGEX-VP5轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在IPTG的誘導(dǎo)下高效表達了GST-VP5融合蛋白(44kD)。通過包涵體純化的方法，獲得的較高純度的融合蛋白，免疫新西蘭兔，Westernblot和ELISA分析表明，制備的融合蛋白抗血清效價在1：12800以上，并具有良好的免疫反應(yīng)性，為進一步研究VP5在I

5、BDV復(fù)制與致病中的作用，以及IBDVVP5基因缺失病毒打下了良好的基礎(chǔ)。 在上述基礎(chǔ)上，進而探索了VP5基因序列及編碼蛋白對IBDV復(fù)制的影響。通過PCR定點突變方法，將IBDVHZ2株A節(jié)段ORFA2(VP5)起始密碼子ATG(97-99nt)突變成cTa的同時，在96-101nt插入NheI酶切位點(GcTaGc)；在此基礎(chǔ)上，分別在另外兩個A節(jié)段突變體中刪除102-107nt和102-128nt序列。脂質(zhì)體介導(dǎo)下，將含有

6、上述3個A節(jié)段突變體的真核表達載體pCI-Nhe1、pCI-Nhe2、pCI-Nhe3，以及pCI-AKHZ2，分別與pCI-mBHZ2共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維(CEF)細胞。收集轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)液上清不斷地接種新鮮細胞，模擬病毒“傳代”，普通光鏡下可以觀察到細胞形態(tài)產(chǎn)生了類似野生IBDV感染細胞導(dǎo)致的細胞病變效應(yīng)(CPE)；電子顯微鏡下可以看到符合IBDV病毒粒子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)；間接免疫熒光分析表明所有共轉(zhuǎn)染組傳代細胞中均有病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達，但是

7、只能在pCI-AKHZ2/pCI-mBHZ2共轉(zhuǎn)染組傳代細胞中觀察到非結(jié)構(gòu)蛋白(VP5)的表達；RT-PCR、酶切鑒定和序列測定驗證了所引入的分子標記，證實缺陷型IBDV獲得拯救，依次命名為ANhe1、ANhe2和ANhe3。實驗進一步通過比較各毒株在感染性、結(jié)構(gòu)蛋白表達水平的差異，探討了VP5基因5'端27bp(ORFA1和ORFA2非重疊區(qū))對病毒復(fù)制的影響。提示VP5蛋白對病毒的復(fù)制具有調(diào)節(jié)作用；ORFA1和ORFA2非重疊區(qū)序列

8、對病毒復(fù)制具有很大的影響，推測該區(qū)域包含或部分包含了一個基因表達調(diào)控元件。 進一步驗證了VP5的缺失對IBDVANhe2株在雛雞體內(nèi)復(fù)制的影響。14日齡雛雞分別接種IBDVANhe2和HZ2株，接種后按一定時段收集法氏囊進行病理學(xué)和病毒學(xué)檢測，結(jié)果表明ANhe2株病毒在體內(nèi)可保持遺傳穩(wěn)定性，兩株病毒均只能導(dǎo)致雛雞法氏囊一過性的輕微病理過程，其中ANhe2株接種導(dǎo)致的法氏囊萎縮過程和病理組織學(xué)變化明顯減輕；接種后，兩株病毒均可在法

9、氏囊淋巴細胞中短暫增殖，并持續(xù)感染一段時間。ANhe2株病毒的增殖速度相對較慢，直到感染后7d才出現(xiàn)高峰，而HZ2株出現(xiàn)的增殖過程非常短暫，在接種后3d，病毒滴度即開始明顯下降。結(jié)果表明VP5的缺失導(dǎo)致了IBDVHZ2株病毒的進一步減毒，然而VP5的缺失并不能使其毒力完全消失，提示VP5更可能是IBDV復(fù)制的一個調(diào)節(jié)因子。 VP5的缺失對IBDVANhe2株誘導(dǎo)機體保護性免疫的影響。兩株病毒在28日齡加強免疫后3周，均可對標準強