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文檔簡介
1、雞傳染性法氏囊病(InfectiousBursalDisease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的雞的一種高度接觸性傳染病。病毒在法氏囊的B淋巴細胞中迅速繁殖,損傷法氏囊的B淋巴細胞,引起嚴重的免疫抑制,從而導(dǎo)致疫苗免疫失敗和繼發(fā)感染的發(fā)生,對養(yǎng)雞業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。IBDV屬于雙RNA病毒科的成員,病毒基因組由A,B兩個片段的雙股RNA組成。其中,基因組B片段編碼病毒蛋白VP1,它是一種RNA依賴性的RNA聚合酶;基
2、因組A片段包含2個部分重疊的開放閱讀框架(ORF),小ORF編碼分子量為17kDa的非結(jié)構(gòu)蛋白VP5;大ORF編碼一種分子量約110kDa的前體多聚蛋白,該蛋白在翻譯后進一步加工形成VP2、VP3和VP4,形成IBDV的結(jié)構(gòu)蛋白,參與病毒核衣殼的形成,攜帶病毒主要中和性B細胞抗原表位,誘導(dǎo)中和性抗體的產(chǎn)生。 B細胞抗原表位又稱抗原決定簇,是抗原分子上能夠被抗體分子識別的部位,在蛋白質(zhì)抗原中一般由幾個直接相鄰或構(gòu)象上相鄰的氨基酸組
3、成,決定著機體產(chǎn)生抗體的特異性,是誘導(dǎo)體液免疫的基本單位。對以體液免疫反應(yīng)為主IBDV來說,鑒定其B細胞抗原表位便是揭示IBD體液免疫的本質(zhì)。 本項研究應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建了VP2和VP3基因原核表達載體pETVP2和pETVP3,并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達了雞IBDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2和VP3。表達蛋白能夠與雞IBDV抗血清特異性反應(yīng),應(yīng)用該表達蛋白鑒定出11株單克隆抗體識別VP2蛋白,2株單克隆抗體識別VP3蛋白。 然后
4、,在應(yīng)用生物信息學(xué)原理分析雞IBDVVP2-4-3蛋白結(jié)構(gòu)特性的基礎(chǔ)上,合成了VP216-mer重疊多肽51條,VP212-mer重疊多肽64條,VP320-mer重疊多肽28條,VP312-mer重疊多肽30條,VP412-mer重疊多肽33條。合成多肽與載體蛋白BSA偶聯(lián)后,經(jīng)peptide-ELISA和Dot-ELISA檢測其與雞IBDV單克隆抗體或多抗的反應(yīng)性。結(jié)果顯示,VP2中含有5個中和性單克隆抗體識別的線性表位:EP1:3
5、7TLRSETSTYNLTV49;EP2:76SNGNYKF82;EP3:201DRPRVYTITAADDYQFS217;EP4:326SWSARGSLAVTI337;EP5:403SERDRLGIKTVW414和6個多抗反應(yīng)位點:ES1:91NLPASYNYCRLVSRSLTV108;ES2:331GSLAVTIHGGNYPGALRPVTLV352;ES3:371FELIPNPELAKNLVTEYG388;ES4:433NSPLKIA
6、GAFGFK445;ES5:449RAIRRIAVPVVS460;ES6:495ASGKARAASGRIRQLTLA512。VP3中含有2個中和性單克隆抗體識別線性表位:728PRDWDRLPYLNL739;982PKPKPKPNAPTQ993和4個多抗反應(yīng)位點:ES7:818LANAPQAGSKSQRA831,ES8:851QREKDTRISKKMETMGIYFATP872,ES9:876ALNGHRGPSPGQLKYWQNTREI8
7、97,ES10:961QMKDLLLTAMEMK973。VP4中含有2個多抗識別位點:ES11:531VVDGILASPGVLRGAHNLDCVLREGATL558,ES12:593PSQRGSFIRTLSGHRVYGYAPDGV616。VP2和VP3單克隆抗體識別的抗原表位多肽同時也能夠與雞IBDV多抗血清反應(yīng)。 應(yīng)用噬菌體展示的隨機7肽庫對雞IBDVVP2蛋白中和性單克隆抗體YNW17和YNW29進行生物淘選,單克隆抗體YN
8、W17和YNW29識別噬菌體展示外源多肽的基序分別為D-X-P-R和A-R-G。序列比對分析這兩株單克隆抗體識別的多肽基序分別位于VP2氨基酸201-204和329-331。通過重疊多肽合成技術(shù)和單克隆抗體抑制實驗證明單克隆抗體YNW17識別VP2表位的氨基酸序列為:197CDSSDRPRVYTIT209單克隆抗體YNW29識別表位的序列為:329ARGSLAVTI337。進一步精確定位了表位EP3和EP4的序列范圍。應(yīng)用單克隆抗體YN
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