傳染性法氏囊病病毒VP4和VP5蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及對(duì)Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的影響.pdf

1、雞傳染性法氏囊病是由雞傳染性法氏囊病病毒(Infections bursal disease virus，IBDV)引起的一種急性、高度接觸性和免疫抑制性的傳染病。IBDV屬于雙RNA病毒科雙RNA病毒屬，IBDV基因組有兩個(gè)雙股的RNA片段，分別為A片段和B片段。A片段長(zhǎng)約3.2 kb，包括兩個(gè)部分重合的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），第一個(gè)ORF編碼VP5，第二個(gè)ORF編碼VP2-VP4-VP3。VP4是

2、病毒的蛋白酶，具有絲氨酸(Ser)蛋白酶的活性，因此，VP4的主要作用是對(duì)多聚前體蛋白VP2-VP4-VP3進(jìn)行加工，放出VP2和VP3兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白。VP5蛋白是一種非結(jié)構(gòu)蛋白，在IBDV感染的過(guò)程中能夠引起細(xì)胞凋亡。
　?、裥透蓴_素（Interferon，IFN）是機(jī)體細(xì)胞抵抗病毒感染的第一道防線(xiàn)。Ⅰ型IFN的產(chǎn)生乖發(fā)揮效應(yīng)是通過(guò)IFN產(chǎn)生的信號(hào)通路（IFN Production Pathway）和IFN發(fā)揮效應(yīng)的信號(hào)通路

3、（IFN Working Signal Pathway）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。具體而言，病毒感染機(jī)體后，細(xì)胞能夠產(chǎn)生Ⅰ型IFN并且很快釋放到細(xì)胞外，從而使細(xì)胞建立抗病毒狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，IBDV能夠通過(guò)抑制IFN基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制機(jī)體的先天性免疫應(yīng)答，但究竟是IBDV的哪個(gè)蛋白參與引起機(jī)體Ⅰ型IFN的下調(diào)，并未做深入研究。
　　本研究將構(gòu)建IBDV各病毒蛋白基因的真核表達(dá)載體，與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，運(yùn)用研究Ⅰ型IFN信號(hào)通路的經(jīng)典方法熒光

4、素酶試驗(yàn)，研究IBDV的VP4和VP5蛋白對(duì)RIG-Ⅰ(Retinoic acid-inducible geneⅠ)介導(dǎo)的信號(hào)通路、IRF3(Interferon regulatoryfactor3，IRF3)、NF-κB(Nuclear factor kappa B)等IFN產(chǎn)生或者發(fā)揮效應(yīng)的信號(hào)通路，尤其是JAK-STA信號(hào)通路的影響。為研究IBDV的感染和發(fā)病機(jī)制提供重要的理論參考，并為預(yù)防和控制IBDV感染提供新的靶向分子。主要

5、研究?jī)?nèi)容如下:
　　試驗(yàn)Ⅰ.IBDV病毒蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
　　為了構(gòu)建病毒蛋白基因的真核表達(dá)載體，根據(jù)IBDV CV03株各基因片段測(cè)序的基因序列和GenBank發(fā)表的B87株的基因序列，設(shè)計(jì)一系列N端帶Flag標(biāo)簽的引物，分別用于擴(kuò)增CV03株VP1、VP2、VP3、VP4和VP5以及B87株VP4和VP5蛋白的基因，連接pMD19-T載體進(jìn)行序列分析，將正確的序列連接真核表達(dá)載體pCI-neo，構(gòu)建各基因

6、的真核表達(dá)載體pCI-CV03VP1、pCI-CV03VP2、pCI-CV03VP3、pCI-CV03VP4、pCI-CV03VP5及pCI-B87VP4和pCI-B87VP5并進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果符合目的基因條帶大小。用Western-blotting檢測(cè)真核表達(dá)載體在Vero細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示有符合目的蛋白大小的特異性條帶存在，IFA檢測(cè)進(jìn)一步證明了所構(gòu)建的真核表達(dá)載體具有較好表達(dá)能力。
　　試驗(yàn)Ⅱ.VP4和VP5蛋白

7、對(duì)Ⅰ型IFN產(chǎn)生和發(fā)揮作用信號(hào)通路的影響
　　為了研究IBDV VP4和VP5蛋白對(duì)Ⅰ型IFN產(chǎn)生和發(fā)揮作用的信號(hào)通路Jak-stat信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，構(gòu)建了IBDV CV03株所有的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白基因的真核表達(dá)載體，與pIFN-β-Luc報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，轉(zhuǎn)染poly(I∶C)進(jìn)行刺激，發(fā)現(xiàn)IBDV的VP4蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白VP5能夠明顯降低IFN-β啟動(dòng)子的活性，從而明顯降低IFN的產(chǎn)生，而VP1、VP2和VP

8、3的作用相對(duì)較弱。同時(shí)用弱毒株B87的VP4和VP5蛋白基因的真核表達(dá)載體，與CV03的VP4和VP5作對(duì)照，與pIFN-β-Luc報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pcDNA3-RIG-Ⅰ刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩株病毒的VP4和VP5蛋白能夠明顯抑制RIG-Ⅰ介導(dǎo)IFN信號(hào)通路的活性。分別將報(bào)告質(zhì)粒p4xIRF3-Luc和pNF-κB-Luc與兩株病毒的VP4和VP5蛋白基因的真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)，VP4和VP5蛋白能夠明顯