CML基因疫苗的構建及表達bcr-abl融合基因片段的SP2-0細胞系的建立.pdf

1、該研究從以下三個方面探索利用bcr-abl融合基因片段制備CML基因疫苗的研究.一、慢性髓性白血病bcr-abl融合基因片段的克隆與原核表達的研究 以慢性髓性白血病細胞株K562細胞總RNA為模板,采用RT-PCR技術擴增包含bcr-abl融合位點周圍的基因片段,定向克隆到pGEX-6P-1載體谷光甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)的下游.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株,以1.0mmol/l IPTG誘導bcr-abl融合基因片段的表達,其產(chǎn)

2、物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定,結果證實該融合蛋白分子量約42KD.用該表達產(chǎn)物免疫ICR小鼠,所制備的抗血清可與K562細胞中特異性抗原結合,表明該bcr-abl/GST融合蛋白具有bcr-abl基因產(chǎn)物的特異抗原性.二、慢性髓性白血病bcr-abl融合基因片段真核細胞表達的研究 根據(jù)bcr-abl(b3a2)融合基因序列設計-對引物,以CML K562細胞總RNA為模板,通過RT-PCR擴增包含bcr-abl融合位點周圍的450bp的基

3、因片段,并將其克隆進pGEM-T easy載體.經(jīng)序列測定證實其閱讀框架正確后,將bcr-abl融合基因片段正向插入真核表達載體pcDNA3.1.以脂質(zhì)體介導重組質(zhì)粒pcDNAbcr-abl轉(zhuǎn)染CHO細胞,間接免疫熒光檢測結果顯示,pcDNAbcr-abl轉(zhuǎn)染CHO細胞的免疫熒光強度高于K562陽性對照細胞.用該重組質(zhì)粒DNA免疫BALB/c小鼠可產(chǎn)生特異性抗體.三、穩(wěn)定表達bcr-abl融合基因片段的人-鼠嵌合腫瘤細胞系的建立從重組克

4、隆載體pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并將其亞克隆進反轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN中.脂質(zhì)體介導重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSNbcr-abl轉(zhuǎn)染包裝細胞PT67,G418篩選后獲得穩(wěn)定產(chǎn)病毒的包裝細胞.收集病毒上清感染SP2/0細胞(H-2<'d>),經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達bcr-abl融合基因片段的SP2/0細胞株.PCR證實bcr-abl融合基因片段已穩(wěn)定整合于SP2/0細胞基因組中,RT-PCR證實感染后的S