慢性髓細(xì)胞白血病BCR-ABL融合基因片段的克隆表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf

1、慢性髓細(xì)胞白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)具有特征性的BCR-ABL融合基因。較多的研究已證明，BCR-ABL融合基因及其表達(dá)蛋白p210<'bcr-abl>在CML的致病中起關(guān)鍵作用，因此，BCR-ABL融合蛋白的檢測對CML的研究和診斷具有重要意義。p210<'bcr-abl>融合區(qū)可作為腫瘤特異性標(biāo)志物，至今為止，還未發(fā)現(xiàn)針對p210<'bcr-abl>融合區(qū)單克隆抗體的報(bào)道，這已經(jīng)成為CML基礎(chǔ)

2、和臨床研究工作的瓶頸之一。缺少針對p210<'bcr-abl>融合區(qū)單克隆抗體的真正原因，究竟是由于p210<'bcr-abl>融合區(qū)沒有BCR(B細(xì)胞受體)識別表位，還是因?yàn)閜210<'bcr-abl>融合區(qū)單克隆抗體制備的特殊性所致，這引起我們的興趣。本研究的目的是研制p210<'bcr-abl>融合蛋白的單克隆抗體并試圖篩選到針對融合區(qū)的單克隆抗體，為本實(shí)驗(yàn)室CML的研究提供一種方便、有效的工具。 1．慢性髓細(xì)胞白血病BC

3、R-ABL融合蛋白融合區(qū)B細(xì)胞表位預(yù)測我們選擇了BCR-ABL融合基因b3a2融合位點(diǎn)周圍151個(gè)氨基酸序列，采用EMBOSS軟件及DNAstar軟件，結(jié)合Hopp＆Woods親水性參數(shù)、Janin可及性參數(shù)、極性參數(shù)、柔韌性參數(shù)及二級結(jié)構(gòu)方案，對慢性髓細(xì)胞白血病BCR-ABL融合蛋白融合區(qū)的B細(xì)胞表位進(jìn)行了預(yù)測。通過多個(gè)參數(shù)預(yù)測結(jié)果表明，p210<'bcr-abl>融合區(qū)可能存在B細(xì)胞表位，該研究對應(yīng)用合成肽抗原制備融合區(qū)單克隆抗體具

4、有重要的指導(dǎo)意義。 2．BCR-ABL融合基因片段的克隆、表達(dá)與表達(dá)蛋白的純化和免疫原性分析以帶有BCR-ABL全長cDNA序列的重組質(zhì)粒MIG210為模板，采用PCR方法擴(kuò)增包含BCR-ABL(b3a2)融合位點(diǎn)周圍約470bp的基因片段，將其定向克隆到pQE-31載體內(nèi)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15菌株，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)含有6×His-tag的融合蛋白p18<'bcr-abl>并對其進(jìn)行純化，免疫BALB/c小鼠。間接ELISA證實(shí)

5、，免疫小鼠血清內(nèi)能夠檢測到針對p210<'bcr-abl>的特異性抗體。說明該表達(dá)產(chǎn)物具有p210<'bcr-abl>融合蛋白的特異抗原性，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。 3．抗BCR-ABL融合蛋白單克隆抗體的研制及其特性用純化的p18<'bcr-abl>融合蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，采用間接ELISA試驗(yàn)方法反復(fù)篩選陽性克隆，并經(jīng)有限稀釋法3次亞克隆，結(jié)果獲得了6株特異性分

6、泌抗BCR-ABL融合蛋白的陽性雜交瘤細(xì)胞株。Western-blotting方法鑒定結(jié)果表明，這些單抗可識別慢性髓細(xì)胞白血病陽性細(xì)胞株K562蛋白提取液的210kD的BCR．ABL蛋白和145kD的c-abl蛋白，表明單抗特異性識別BCR-ABL蛋白abl端。我們將這六株雜交瘤細(xì)胞分別命名為抗abl-1A4、抗abl-2C5、抗abl-2H1、抗abl-4G2、抗abl-5F6、抗abl-5G4。這6株單抗的腹水ELISA效價(jià)為1:1