BCR-ABL(Breakpoint Cluster Region-Abelson Leukemia Virus)融合基因激酶區(qū)T315I突變質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、目的：構(gòu)建BCR-ABL融合基因激酶區(qū)T315I突變型和野生型質(zhì)粒。
　　方法：在我院確診的CML患者伊馬替尼治療后發(fā)生耐藥,經(jīng)基因測序證實(shí)存在T315I點(diǎn)突變。1.取患者血液標(biāo)本后通過分離白細(xì)胞提取RNA;2.應(yīng)用第一鏈cDNA合成試劑盒對RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;3.針對T315I突變區(qū)域設(shè)計(jì)特定PCR引物,通過PCR反應(yīng)大量擴(kuò)增DNA;4、應(yīng)用T4DNA連接酶將目標(biāo)片段與pGEM-T質(zhì)粒載體連接;5.應(yīng)用細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)將目標(biāo)轉(zhuǎn)

2、入JM109感受態(tài)大腸桿菌,在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)大腸桿菌后在含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB平板上培養(yǎng);6.含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在具有生色誘導(dǎo)的培養(yǎng)基上只能形成白色菌落,通過藍(lán)白篩選挑選單克隆菌落;7.將挑取的單克隆菌落在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中增殖大量復(fù)制轉(zhuǎn)化質(zhì)粒;8.用質(zhì)粒抽取試劑盒提取培養(yǎng)后的菌液質(zhì)粒;9.將對應(yīng)菌落所得的菌落送生物測序公司,應(yīng)用質(zhì)粒測序技術(shù)檢測單克隆菌落轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒DNA序列;10.挑取存在T

3、315I點(diǎn)突變的質(zhì)粒和野生型菌落再次培養(yǎng)后提取制備大量質(zhì)粒。
　　結(jié)果：構(gòu)建了單純發(fā)生BCR-ABL融合基因激酶區(qū)T315I突變和野生型的質(zhì)粒,為后續(xù)試驗(yàn)建立一種檢測BCR-ABL融合基因激酶區(qū)T315I突變的簡便的檢測方法提供基礎(chǔ)。
　　結(jié)論：隨著TKI治療CML患者發(fā)生耐藥突變增多,目前針對點(diǎn)突變的檢測方法主要為測序法,其檢測程序繁瑣,操作周期長,檢測費(fèi)用高昂,另有些其他檢測方法仍因技術(shù)、設(shè)備等原因未實(shí)現(xiàn)普及。本實(shí)驗(yàn)中在