豬IFITM基因分析及過量表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建.pdf

1、干擾素(Inferons，IFN)是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、免疫反應(yīng)、抗腫瘤及抗病毒等多種重要生理功能的細(xì)胞因子，通過IFN誘導(dǎo)干擾素刺激基因編碼的蛋白家族(ISGs)組成的信號網(wǎng)絡(luò)完成其信號傳導(dǎo)過程。干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白IFITM(inferon-inducible transmemberaneproteins)是系列ISGs中的一個家族，干擾素誘導(dǎo)后可大量表達(dá)。近幾年發(fā)現(xiàn)IFITM蛋白可抑制多種病毒的復(fù)制。
　　IFITM在人、畜

2、、禽、鼠等多種生物中都有表達(dá)，在進(jìn)化上也非常保守，但不同物種中報道的IFITM基因種類和數(shù)量都有一定的差異。人類共有IFITM1、IFITM2、IFITM3和IFITM5基因的表達(dá)，其中IFITM1、IFITM2和IFITM3廣泛表達(dá)于多種組織中，而IFITM5僅在成骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。而鼠中除了有IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5外，還有IFITM6和IFITM7的存在。最近有文獻(xiàn)報道IFITM蛋白具有抗甲型流感病毒（I

3、nfluenzaA virus，IAV）等一些黃病毒屬病毒及艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)等多種病毒的功能，引起了廣泛關(guān)注。本論文主要以豬IFITM基因的序列、結(jié)構(gòu)、表達(dá)及其對乙腦病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）的影響進(jìn)行了研究。
　　本論文主要研究結(jié)果有:
　　1、IFITM基因的克隆及其序列分析。通過序列對比已知的IFITM基因的CDS

4、區(qū)保守序列，設(shè)計特異性的引物，從豬腎細(xì)胞PK15中擴(kuò)增出豬IFITM基因，提交序列至NCBI。
　　2、IFITM基因的進(jìn)化分析。以豬組織的總DNA為模板，擴(kuò)增出IFITM1、IFITM2、IFITM3等3個基因的全長序列，經(jīng)過分析和序列對比，三個基因都含有一個內(nèi)含子，并確定這三個基因均位于豬的2號染色體上。在豬基因組中尚未發(fā)現(xiàn)完整的IFITM5和IFITM10。通過繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)豬IFITM與牛(Bos taurus)IFI

5、TM基因的同源性最高達(dá)到77％以上，牛和鼠的IFITM5同源率高達(dá)90％以上。
　　3、IFITM基因的組織表達(dá)分析。采集了豬的不同組織提取RNA，分別擴(kuò)增IFITM1、IFITM2、IFITM3的基因序列，發(fā)現(xiàn)IFITM1、IFITM2和IFITM3在各組織中的表達(dá)有較大差異。IFITM1和IFITM3在一些組織（如肝和腎）中表達(dá)量較大，而IFITM2僅在豬脾臟組織中檢測出有表達(dá)。
　　4、抗JEV功能的初步分析。將豬的I

6、FITM1、IFITM2和IFITM3分別連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上，分別構(gòu)建了三個重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-IFITM1、pcDNA3.1(+)-IFITM2和pcDNA3.1(+)-IFITM3，瞬時轉(zhuǎn)染至PK15細(xì)胞，然后進(jìn)行JEV感染實驗，細(xì)胞病變分析及RT-PCR結(jié)果分析表明三組IFITM基因?qū)EV具有不同程度的抑制作用。
　　5、穩(wěn)定表達(dá)IFITM細(xì)胞系的構(gòu)建。將構(gòu)建好的三個重組質(zhì)粒pcDNA3