新城疫病毒分離株F基因的序列分析及F-,48-E-,9-株和La Sota株F基因的真核表達(dá).pdf

1、本試驗(yàn)利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分別擴(kuò)增出NDV青海株(QH3)、黑龍江株(HLJ)和甘肅株(A4)的融合蛋白基因的全長(zhǎng)核苷酸，再克隆到pMD18-T載體中。經(jīng)酶切和質(zhì)粒PCR鑒定，證明獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒后，進(jìn)行序列測(cè)定并推導(dǎo)出其氨基酸序列，同時(shí)進(jìn)行了分析和比較。序列分析結(jié)果表明，所獲得的3株分離株F基因完整的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1662bp，共編碼F蛋白的553個(gè)氨基酸；QH3、HLJ和A4株均有相同的6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，

2、其F基因的裂解位點(diǎn)為112R-R-Q-K/R-R-F117，符合強(qiáng)毒株裂解區(qū)氨基酸組成的特征，且與MDT和ICPI的測(cè)定結(jié)果相吻合。 根據(jù)122株國(guó)內(nèi)外NDVF基因1～374bp的核苷酸序列繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)：QH3株NDV為基因Ⅷ型；A4株NDV為基因Ⅵ型；HLJ株NDV為基因Ⅸ型。表明我國(guó)NDV流行毒株在各地區(qū)之間具有明顯的基因型差異，而且還具有不同于國(guó)外流行的我國(guó)特有的基因型——基因Ⅸ型。通過(guò)對(duì)NDVF基因核苷酸序列同

3、源性比較及遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)：我國(guó)不同年代、不同地區(qū)分離的NDV毒株與疫苗毒株之間在基因水平上存在較大差異，這種差異對(duì)氨基酸及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能可能會(huì)有一定影響，而NDVF蛋白的差異同時(shí)也造成免疫原性的差異，這很可能是新城疫的免疫防治十分困難的原因之一。為了具體分析流行毒株和疫苗毒株之間的免疫原性差異情況和建立適用于檢測(cè)ND免疫和流行情況的方法，我們又分別表達(dá)了弱毒疫苗株LaSota和標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9的F蛋白。 試驗(yàn)中首先根據(jù)

4、已知的新城疫病毒融合蛋白(FusionproteinF)基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成了F基因特異性引物。將F48E9株和LaSota株F基因克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMHTa中，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBacHT-F48F、pFastBacHT-LaF，然后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，以L(fǎng)B/AMP±平板篩選陽(yáng)性重組子并測(cè)序。測(cè)序正確后轉(zhuǎn)化至E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素三種抗性培養(yǎng)和用I

5、PTG、X-gal進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，篩選出白色菌落，經(jīng)PCR鑒定證明獲得陽(yáng)性穿梭轉(zhuǎn)座子rBacmid-F(分別命名為rBacmid-F48F和rBacmid-LaF)，提取重組BacmidDNA，在質(zhì)脂體轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞。在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)，重組Bacmid經(jīng)復(fù)制、表達(dá)、裝配、形成重組桿狀病毒，經(jīng)PCR擴(kuò)增，證明目的基因片段插入到桿狀病毒基因組中，經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析，證實(shí)NDV