C3d分子佐劑核酸疫苗的構(gòu)建與免疫效果研究.pdf

1、近年來，隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，運用基因重組表達技術(shù)研制預(yù)防、治療用生物制品己經(jīng)成為免疫學(xué)領(lǐng)域研究的熱點，其中核酸（DNA）疫苗倍受青睞。該疫苗是繼滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗及基因工程疫苗后的新一代疫苗。
　　 核酸疫苗具有同時激發(fā)機體體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答、使用安全、易于生產(chǎn)等優(yōu)點，并可將多種基因聯(lián)合在一起制成基因聯(lián)合疫苗。然而由于DNA 疫苗蛋白表達量低，激發(fā)的免疫應(yīng)答較弱，從而限制了其開發(fā)應(yīng)用速度。因此，

2、提高DNA 疫苗的免疫效果已成為基因免疫研究中急需解決的問題；目前常采用新型分子佐劑，如白細(xì)胞介素、干擾素、胸腺肽和補體分子佐劑等是提高DNA 疫苗免疫效果的重要措施，其中補體C3d分子佐劑倍受人們的關(guān)注。
　　 補體C3d分子是補體C3被抗原激活以后的最終裂解片段，能夠促進抗原提呈細(xì)胞對抗原的攝取、提呈作用，增強機體的免疫應(yīng)答能力。因此，C3d 已經(jīng)成為核酸疫苗有效的新型分子佐劑。但是C3d 作為分子佐劑具有種屬差異性，不同種

3、動物間C3d免疫增強作用的差異性需要作進一步的研究。PRRSV GP5基因編碼的GP5蛋白為糖基化囊膜蛋白，該蛋白具有較好的免疫原性，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫。invH基因是沙門氏菌A-E 群的高度保守基因，編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面的蛋白，該蛋白決定沙門菌對腸粘膜細(xì)胞的侵襲力。
　　 本研究首先對哺乳動物豬、鼠的C3d基因進行克隆及序列測定分析，并探討了不同種動物（豬、鼠、雞、鴨）間補體C3d 在基因水平上的相關(guān)

4、性和差異性，然后以PRRSVGP5 為模型基因，利用鼠、豬（哺乳動物）C3d的受體結(jié)合功能區(qū)p28和雞、鴨（禽類動物）C3d的受體結(jié)合功能區(qū)p29 作為分子佐劑，構(gòu)建了C3d-p28(29).n（n=2、4、6）
　　 多聚體分子佐劑PRRSV GP5 核酸疫苗和沙門氏菌pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6 核酸疫苗；用構(gòu)建的核酸疫苗免疫小鼠并對其免疫效果進行了體液和細(xì)胞免疫主要指標(biāo)的檢測，探討不同動物C3d-p28

5、（29）對核酸疫苗的免疫增強作用。本研究主要包括四部分內(nèi)容：
　　 1、哺乳動物豬、鼠補體C3d基因的克隆及序列分析：為了獲得哺乳動物（豬、鼠）的補體C3d基因克隆并比較同禽類動物（雞、鴨）C3d基因序列的差異性，首先從哺乳動物鼠、豬的肝組織中提取總RNA，通過RT-PCR 擴增C3d基因的cDNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后直接克隆到pMD18-T 載體，構(gòu)建pMD18-T-C3d 重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，酶切鑒定并進行序列測定，然

6、后進行C3d序列和CR2 結(jié)合區(qū)同源性比較分析。電泳結(jié)果顯示，分別在936bp和888bp 處呈現(xiàn)明亮的條帶，成功獲得了鼠和豬的C3d基因克隆。
　　 序列分析結(jié)果表明，哺乳動物（豬、鼠）和禽類（雞、鴨）的補體C3d基因同源性僅為64％；進化樹顯示，哺乳動物與禽類的親緣關(guān)系越近，C3d基因進化關(guān)系也越近。哺乳動物（豬、鼠）與禽類（雞、鴨）C3d基因的CR2 結(jié)合區(qū)比較分析發(fā)現(xiàn)，禽類為29個氨基酸，而哺乳動物為28個氨基酸，兩類動

7、物該區(qū)氨基酸的同源性僅為62％，而鼠、豬兩種哺乳動物之間、雞、鴨兩種禽類動物之間的同源性分別達82.8％和84％，證明補體C3d及CR2 結(jié)合區(qū)具有種屬的差異性。
　　 2、不同動物C3d分子佐劑PRRSV GP5 核酸疫苗的構(gòu)建：為探明不同動物C3d分子佐劑在核酸疫苗中的免疫增強作用，在上述試驗克隆了動物C3d cDNA的基礎(chǔ)上，設(shè)計引物克隆C3d-p28(29)至pUC19 載體，利用同裂酶BamHⅠ和BglⅡ構(gòu)建多聚體C3

8、d-p28(29).n，將其克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+)上；然后以RT-PCR 擴增的PRRSVGP5基因作為模式基因，定向克隆至真核表達載體pcDNA3.1-C3d-p28(29).n中p28(29).n上游，構(gòu)建pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n 重組質(zhì)粒。酶切結(jié)果顯示，電泳后在807、987、1167bp 處分別出現(xiàn)了明亮的條帶，表明成功構(gòu)建了含有補體C3d-p28(29)多聚體分子佐劑的PRRSV

9、GP5 核酸疫苗（pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n）。
　　 3、不同動物C3d分子佐劑對PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增強效果研究：為了探索不同動物C3d分子佐劑對PRRSV GP5 核酸疫苗的免疫增強作用及差異性，在構(gòu)建了鼠、豬、雞、鴨四種動物補體C3d-p28(29).n PRRSV GP5 核酸疫苗（pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).2.4.6）及pcDNA3.1-GP5 核酸疫苗的

10、基礎(chǔ)上，分別提取質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至Marc145 細(xì)胞進行瞬時表達，并免疫BALB/c小鼠，然后利用不同ELISA 試劑盒分別檢測各免疫組小鼠的GP5 抗體水平和IL-4、IFN-γ含量。結(jié)果表明，以補體C3d-p28(29).n 為分子佐劑的PRRSV GP5基因重組疫苗均可在Marc145 細(xì)胞內(nèi)進行表達；連接不同動物C3d-p28(29)2,4，6 聚體的核酸疫苗免疫鼠血清中GP5 抗體水平、IL-4和IFN-γ含量均比空載體

11、（pcDNA3.1）和pcDNA3.1-GP5 對照組的升高，差異均顯著，其中以pcDNA3.1-GP5-p28(29).6組的效果最佳，但均不如PRRSV油乳劑滅活苗組的效果好。另外，含有C3d-p28(29).n（n=2,4,6）相同聚體的疫苗免疫組小鼠血清中的GP5 抗體水平、IL-4和IFN-γ含量兩兩比較無差異性。
　　 4、鼠C3d分子佐劑沙門氏菌invH基因核酸疫苗的構(gòu)建及免疫效果研究：為了進一步探討分子佐劑C3d

12、 在細(xì)菌核酸疫苗中的免疫增強作用，以沙門氏菌invH 為核酸疫苗的模式基因，構(gòu)建了pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6 重組質(zhì)粒，免疫BALB/c小鼠并檢測了小鼠血清中invH 抗體和IL-4、IFN-γ的含量，然后進行小鼠攻毒保護試驗。結(jié)果表明，小鼠血清中invH 抗體水平、IL-4和IFN-γ的含量與pcDNA3.1、pcDNA3.1-invH 對照組比較，差異均顯著。通過攻毒試驗結(jié)果表明，pcDNA3.1-invH-m