重組人核糖核酸酶抑制因子對小鼠腦缺血的抗氧化保護作用及其抗腫瘤的研究.pdf

1、背景介紹：核糖核酸酶抑制因子<'[1](Ribonudease Inhibitor，RI)是分布在胞漿內(nèi)酸性糖蛋白，分子量約為50KDa<'[2]，其基因位于染色體11p15.5，三級結(jié)構(gòu)呈對稱的馬蹄型。RI包含15個亮氨酸重復序列(Leucine-rich repeat，LRP)<'[3]>，而且每個R1分子中含有32個高度保守的半胱氨酸殘基，其中至少30個半胱氨酸的巰基以還原型巰基的形式存在，還原型巰基是保持RI正常生物學活性所必需

2、的，這也決定了R1只有在還原性的環(huán)境中才能發(fā)揮其作用。RI是核糖核酸酶A(Ribonuclease A，RNase A)的抑制劑，可以有效地抑制其對RNA的水解作用。RNaseA與血管生成因子(Angiogenin，Ang)的氨基酸有著高度保守的同源順序。Ang是由腫瘤細胞和正常細胞分泌的分子量為14.4kDa的蛋白質(zhì)，屬于RNaseA超家族的一員，在組織和細胞中的分布十分廣泛。血管生成因子在體內(nèi)和體外均具有強烈的誘發(fā)血管生成的活性。R

3、I通過與RNaseA(ki=4.0x10<'-14>M)的緊密結(jié)合而抑制他們的活性<'[4]>。根據(jù)cDNA序列分析，Ang與RNase A有35﹪的同源性；但Ang與RI有更大的親和力(ki=7.1×10<'-16>M)。X射線分析表明，Ang與RNaseA有著極其相似的立體結(jié)構(gòu)，二者都可以與人胎盤RI緊密結(jié)合。由于RI可以與Ang形成緊密的非共價結(jié)合，從而可以抑制其促血管生成的活性。此外RI還可能通過抑制堿性成纖維細胞生長因子(b-

4、FGF)的表達等途徑抑制血管生成。 目的： 1.通過腦缺血再灌注損傷模型的建立，觀察RI對實驗動物腦缺血再灌注損傷的影響。 2.通過RI對黑色素瘤小鼠的腫瘤抑制作用來進一步闡明RI對抑制腫瘤的生長方面的影響。 方法： 1.重組的pGEX-6p-1-hri大腸桿菌中表達和純化將重組的pGEX-6p-1-hri轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta表達菌中，在0.5mmol的誘導劑IPTG和16℃的溫度條件下

5、來誘導表達目的融合蛋白，收集大量培養(yǎng)的菌體，經(jīng)超聲破碎，收集離心后的上清，經(jīng)由 GST 親和層析柱分離純化，及20﹪聚乙二醇8000濃縮。 2．RI對小鼠腦缺血再灌注的影響將純化后的GST-RI腹腔注射到小鼠體內(nèi)，預先保護3天后，手術(shù)分離出頸總動脈，結(jié)扎、制作腦缺血損傷模型<'[6]>。組別為：假手術(shù)組，模型組，GST-RI低劑量治療組，GST-RI中劑量治療組，GST-RI高劑量治療組，GST 治療組，術(shù)后缺血再灌注30min后，第2

6、次給藥(同術(shù)前)，小鼠腦缺血24h后斷頭處死，檢測SOD、MDA、GSH-Px指標，并在光鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)細胞的損傷程度。 3．RI對黑色素瘤小鼠的腫瘤抑制將小鼠黑色素瘤細胞B16接種在小鼠皮下，分別以生理鹽水為陰性對照，以環(huán)磷酰胺為陽性對照，高低劑量的融合蛋白進行治療。觀察GST-RI是否可以抑制腫瘤的生長。 結(jié)果： 融合蛋白GST-RI能顯著降低腦缺血小鼠皮質(zhì)及海馬組織中MDA的含量，能顯著提高腦缺血小鼠

7、腦皮質(zhì)及海馬組織中SOD、GSH-PX的活力。皮下注射GST-RI，對小鼠黑色素瘤的抑制作用與劑量有線性關(guān)系。當劑量為5000U(0.52mg/kg)時抑制率最高可達34.62﹪，當劑量增加到10000U(1.04mg/kg)時抑制率最高可達46.33﹪，平均抑瘤率為40.50﹪。說明GST-RI可以通過抑制腫瘤血管生成的途徑抑制腫瘤的生長，瘤重減輕。 結(jié)論： 融合蛋白GST-RI對腦缺血小鼠腦組織有很強的抗氧化作用，對