重組核糖核酸酶A的表達(dá)和復(fù)性研究.pdf

1、核糖核酸酶A(Ribonuclease A，EC3.1.27.5，RNaseA)在DNA的制備、抑制病毒復(fù)制及作為基礎(chǔ)研究中的模型蛋白等方面具有廣泛的用途和需求，但商品化的RNaseA都是從動物的胰臟中分離提純得到，這不僅限制了其大量獲取，而且造成流程復(fù)雜，生產(chǎn)成本高。因此利用基因工程手段大量獲取具有生物活性的RNase A已成為研究的熱點。目前文獻(xiàn)報道中RNase A的表達(dá)多通過可溶的形式表達(dá)，表達(dá)量少，這限制了其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。<

2、br>　　 基于此，本研究利用PCR技術(shù)從牛胰臟的基因組中擴(kuò)增出RNase A的編碼序列，將其插入到帶組氨酸標(biāo)簽的高效表達(dá)質(zhì)粒pET28a中，然后利用E.coliBL21(DE3)以包含體的形式高效表達(dá)，之后利用稀釋法和金屬螯合色譜法(IMAC)對包含體進(jìn)行了復(fù)性，為其工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　 研究結(jié)果表明，利用PCR技術(shù)從牛胰臟的基因組中擴(kuò)增出RNase A編碼基因，測序結(jié)果表明其與組織DNA的同源性為100

3、％；將此目標(biāo)基因插入到載體pET28a中后，轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)宿主菌中，得到pET28a-RNaseA基因工程表達(dá)菌；RNase A基因的插入沒有影響基因工程菌的生長規(guī)律，經(jīng)過誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白主要以包含體的形式表達(dá)；目標(biāo)蛋白最優(yōu)的表達(dá)條件為：培養(yǎng)菌的OD600為0.4時(約需培養(yǎng)2 h，此時菌體處于對數(shù)生長前期)開始誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG濃度為1 mM，誘導(dǎo)3 h，此條件下RNase A包含體的表達(dá)量為60 mg/L培養(yǎng)液

4、；包含體經(jīng)過脲、表面活性劑和PE緩沖液的洗滌，最終目標(biāo)蛋白的純度達(dá)到83％。
　　 RNase A包含體存在最佳的變性時間(1 h)；稀釋復(fù)性僅可以使低濃度的蛋白(≤0.1 mg/mL)獲得較好的復(fù)性效果(復(fù)性24 h，活性收率為52％)；IMAC法可使蛋白質(zhì)終濃度為0.5 mg/mL的RNaseA復(fù)性24 h后達(dá)到80％的活性收率，同時實現(xiàn)了RNaseA包含體的純化(復(fù)性產(chǎn)物的純度為97％)。與稀釋復(fù)性相比，在相同的蛋白終濃度