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文檔簡介
1、豹蛙酶Onconase(又名:P30 protein,ranpinase),是一種在北方豹蛙(Rana pipiens)卵母細胞和早期胚胎內(nèi)存在的核糖核酸酶,屬于核糖核酸酶A超家族。研究證實它在體內(nèi)外對多種腫瘤均具顯著殺傷作用。
Onconase的抗腫瘤作用和它的核酸酶活性直接相關(guān),Onconase通過降解胞質(zhì)內(nèi)tRNA從而使靶細胞啟動caspase依賴的凋亡途徑。
Onconase是第一個進入Ⅲ期臨床研究的核糖核酸
2、酶藥物,用于治療惡性間皮瘤。Onconase結(jié)構(gòu)獨特,高度穩(wěn)定,分子量小。在臨床上具有副反應(yīng)較輕,免疫原性低和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點,因此Onconase的研究在學術(shù)上和醫(yī)學應(yīng)用上均具重要意義。
我們選用了大腸桿菌表達系統(tǒng)進行Onconase蛋白的原核表達,Bac-To-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)進行真核表達,對兩種表達系統(tǒng)獲得的Onconase蛋白分別進行了純化,以期獲得純度較高的Onconase蛋白。
原核表達系統(tǒng)中以
3、invitrogen公司構(gòu)建的pMD 18-T-Onconase為模板,將其插入到大腸桿菌表達系統(tǒng)的pET-30a(+)質(zhì)粒中,構(gòu)建pET-30a(+)-Onconase質(zhì)粒,重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)菌株,實現(xiàn)了Onconase的高效原核表達。通過SDS-PAGE和Western blotting分析,可見大小約為11 kD的特異性蛋白條帶,表明pET-30a(+)-Onconase在E.coli BL21菌種中
4、成功地表達了His-Onconase融合蛋白。
真核表達系統(tǒng)中以invitrogen公司構(gòu)建的pMD18-T-Onconase為模板,對Onconase基因進行擴增,并將其插入到桿狀病毒Bac-To-Bac表達系統(tǒng)的pFastBacl質(zhì)粒中,構(gòu)建pFastBacI-Onconase質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac后獲得重組穿梭載體Bacmid-Onconase,脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染Sf9細胞后產(chǎn)生了具有強感染力的重組桿狀病毒AcNP
5、V-Onconase。用AcNPV-Onconase感染Sf9細胞,分別收集感染24 h、48 h和72 h后的Sf9細胞;細胞超聲裂解后,通過SDS-PAGE和Western blotting分析,可見大小約為11 kD的特異性蛋白條帶,表明AcNPV-Onconase在Sf9細胞中成功地表達了His-Onconase融合蛋白。
利用Ni-NTA agarose進行變性純化,透析復性,實現(xiàn)原核表達His-Onconase的純
6、化、復性,SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果顯示,成功獲得高純度的His-Onconase融合蛋白。
利用Ni-NTA agarose,在非變性的條件下純化真核表達的His-Onconase融合蛋白,SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果顯示,獲得高純度的His-Onconase融合蛋白。
綜上所述,本研究利用原核及真核表達系統(tǒng)表達了His-Onconase融合蛋白,并純化出了較高
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