布魯氏菌核糖核酸酶RibonucleaseⅢ的酶活性研究.pdf

1、布魯氏菌是一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性細(xì)菌，侵入人畜細(xì)胞后能夠逃避宿主免疫系統(tǒng)并建立慢性感染，但其逃避免疫的機(jī)制還不完全清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)，RibonucleaseⅢ(RNaseⅢ)、RNaseE和Hfq參與非編碼RNA的調(diào)控，進(jìn)而影響基因的表達(dá)。RNaseⅢ廣泛地存在于細(xì)菌、真菌及真核生物中，是一類保守性很高的酶類。在體外，RNaseⅢ能夠切割任何完全配對(duì)的具有雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA，包括細(xì)菌自身RNA及病毒RNA。已有研究表明布魯氏菌能夠

2、通過(guò)4型分泌系統(tǒng)將效應(yīng)蛋白分泌到宿主細(xì)胞中，從而有利于布魯氏菌在細(xì)胞中的運(yùn)輸。布魯氏菌在侵入到宿主細(xì)胞后，是否會(huì)有RNaseⅢ通過(guò)4型分泌系統(tǒng)進(jìn)入到宿主細(xì)胞中，在RNA水平影響宿主基因表達(dá)，以使布魯氏菌能夠更好的潛伏和增殖還未見(jiàn)報(bào)道。
　　本課題克隆了羊種布魯氏菌Brucella melitensis編碼RNaseⅢ的基因rncS，并對(duì)RNaseⅢ的重要氨基酸進(jìn)行突變，獲得rncS突變克隆rncS(E54A、D61A、E81A、E

3、133A)。選擇布魯氏菌編碼的具有雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA BM-pri-0015、BM-pre-0015以及miRBase收錄的人源及偽狂犬病毒編碼的成熟miRNAs的前體Hsa-let-7a-1、Hsa-mir-16-1、PRV-LLT1、PRV-LLT2作為RNaseⅢ的切割底物。首先，用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)RNA和RNaseⅢ的結(jié)合;其次，比較RNaseⅢ在切割這幾種不同來(lái)源的具有雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA生化活性的差異:包括金屬離子（鎂

4、離子和錳離子）對(duì)切割活性的影響，鹽離子（鈉離子和鉀離子）對(duì)切割活性的影響，pH對(duì)酶活性的影響;在此基礎(chǔ)上，檢測(cè)RNaseⅢ突變體的酶活，確定對(duì)RNaseⅢ酶活起到重要作用的氨基酸。本課題所得結(jié)果如下:
　　1.凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)表明RNaseⅢ不僅可以和布魯氏菌編碼的RNA結(jié)合，也可以和來(lái)自人源的及病毒的RNA結(jié)合;
　　2.RNaseⅢ在含有錳離子或者鎂離子時(shí)才能發(fā)揮切割活性，不同的底物所需的金屬離子最適濃度不一樣;