三氯乙烯抑制人胚胎干細胞向心肌分化的機制研究.pdf

1、目的：
　　探討三氯乙烯(TCE)對人胚胎干細胞向心肌細胞分化的影響及其機制。
　　方法：
　　以人胚胎干細胞H9體外心肌定向分化為基礎(chǔ)，培養(yǎng)液中添加不同劑量的TCE（處理組分別為：100 ppb組，1 ppm組，10 ppm組）以及二甲基亞砜（DMSO，對照組）。對誘導(dǎo)后形成的擬胚體以及不同發(fā)育階段的細胞進行檢測：MTT法測定細胞生存力，直觀統(tǒng)計擬胚體自主節(jié)律性搏動次數(shù)，流式細胞儀計數(shù)分析細胞分化比例，熒光定量PCR

2、檢測心肌特異性基因表達，免疫熒光法檢測各個時期相關(guān)蛋白表達，基因芯片法觀察TCE對心肌細胞鈣離子通道相關(guān)基因表達的影響。
　　結(jié)果：
　　1.胚胎干細胞向心肌成功定向分化
　　隨著時間的推移，細胞依次經(jīng)過多能干細胞期，擬胚體懸浮期以及自發(fā)節(jié)律性搏動的貼壁擬胚體形成期?？梢杂^測到胚胎干細胞(ESC)形態(tài)發(fā)生變化，用階段特異性標(biāo)記物作RT-PCR，結(jié)果顯示心肌細胞分化成功。
　　2.TCE的細胞毒性作用
　　M

3、TT法顯示，所檢測的濃度對于未分化的胚胎干細胞和終末分化的心肌細胞的細胞活性均不產(chǎn)生明顯的細胞毒性作用(n=12,P>0.05)。說明所用劑量的TCE本身不影響細胞活性。
　　3.TCE抑制人胚胎干細胞的心肌定向分化
　　隨著體外培養(yǎng)時間的延長，觀測到的擬胚體搏動數(shù)目增加，自發(fā)搏動擬胚體發(fā)生的時間比對照組向后推移，流式細胞檢測顯示，隨著TCE濃度增加，心肌特異性標(biāo)志物cTnt的陽性率不斷降低，表明TCE對于心肌分化的抑制具有

4、明顯的劑量依賴性。
　　收集培養(yǎng)D21的各組劑量處理的細胞，用免疫熒光法檢測cTnt蛋白表達，結(jié)果顯示細胞受累區(qū)域明顯增大。
　　4.TCE抑制心肌分化階段標(biāo)志物的表達
　　TCE對于多能基因Nanog、Tert和Sox2、中胚層形成相關(guān)基因Gata4和T的表達水平?jīng)]有顯著影響(P>0.05)。但TCE能夠顯著影響成熟期心肌標(biāo)志物cTnt和Mhy-7的表達水平，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性下調(diào)，說明TCE影響心肌細胞從心肌前

5、體期到成熟心肌分化的轉(zhuǎn)變。
　　5.TCE對心肌鈣離子通道相關(guān)基因表達的影響
　　q-PCR結(jié)果顯示鈣離子通道相關(guān)基因Serca2和Cav1.2表達水平顯著下調(diào)，說明TCE干擾心肌細胞鈣離子通道基因的表達。
　　將具有自主性節(jié)律搏動的心肌細胞進行芯片分析，發(fā)現(xiàn)這些能夠自主搏動的細胞其鈣離子通道相關(guān)基因的數(shù)目總體呈現(xiàn)下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　三氯乙烯抑制心臟祖細胞向心肌細胞的分化過渡，降低成熟心肌分化的比例，干