殺香魚假單胞菌胞外蛋白鑒定及候選毒力因子篩選.pdf

1、作為水生動物常見病原菌，假單胞菌以其低溫致病的特性加大了其預(yù)防難度，對水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控提出了新的挑戰(zhàn)。本文對大黃魚內(nèi)臟白點病的病原殺香魚假單胞菌胞外蛋白進行鑒定，以期從中篩選出受溫度調(diào)控的毒力因子，為開展殺香魚假單胞菌致病機理研究及預(yù)防提供基礎(chǔ)。
　　在低溫環(huán)境使用蛋白超濾濃縮管，制備出保留活性的殺香魚假單胞菌胞外蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳，采用改進染色方案，結(jié)果顯示在實驗室中不同培養(yǎng)溫度下該菌分泌到胞外的蛋白樣品存在可鑒別

2、的差異性，且部分蛋白條帶僅在較低溫度時發(fā)現(xiàn)。利用LC-MS/MS將胞外蛋白混合樣品不經(jīng)分離，直接進行酶解及質(zhì)譜鑒定，初步鑒定出Hcp、Hcp1、PcrV、ExoU、SseC、SopD與YopD等毒力因子。殺香魚假單胞菌的胞外蛋白樣品經(jīng)24cm pH3-10的IPG預(yù)制膠條進行雙向電泳分離，獲得了殺香魚假單胞菌胞外蛋白在20℃和30℃下的2-DE圖譜。對2-DE圖譜的差異蛋白點進行篩選，選取鑒定了21蛋白點，鑒定發(fā)現(xiàn)其中3個點是該菌毒力因

3、子Hcp與Hcp1，且在溫度差異影響下存在顯著的蛋白水平表達(dá)差異。其他毒力因子在選取的21個蛋白點質(zhì)譜中均未檢出。
　　根據(jù)殺香魚假單胞菌全基因組序列設(shè)計引物對其毒力基因的mRNA表達(dá)水平進行了熒光定量PCR檢測。檢測結(jié)果顯示，殺香魚假單胞菌Hcp、Hcp1、PcrV、ExoU、SseC、SopD與YopD各毒力因子在mRNA水平上存在顯著的表達(dá)差異。溫度恒定培養(yǎng)條件下，20℃樣品各候選毒力因子表達(dá)水平普遍高于30℃樣品。溫度變化

4、刺激下，代表性毒力因子Hcp基因的表達(dá)水平對溫度變化敏感，響應(yīng)低溫誘導(dǎo)表達(dá)。設(shè)計引物克隆獲得殺香魚假單胞菌各毒力基因全長，對克隆獲得的各毒力基因進行原核表達(dá)。成功構(gòu)建了表達(dá)載體并培育出各毒力因子能穩(wěn)定表達(dá)的菌株。經(jīng)驗證，構(gòu)建的表達(dá)載體閱讀框正確，可穩(wěn)定表達(dá)各毒力基因，表達(dá)的蛋白產(chǎn)物以包涵體形式存在于表達(dá)菌株胞內(nèi)，可用水煮裂解法提取。
　　本研究對殺香魚假單胞菌的胞外蛋白主要毒力因子進行了鑒定及表達(dá)變化分析，篩選出了受低溫誘導(dǎo)表達(dá)的