產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶變形假單胞菌的篩選鑒定及酶的定向改造.pdf

1、精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase, ADI，EC3.5.3.6)，屬于一類稱為“胍基修飾酶”總科，催化精氨酸產(chǎn)生瓜氨酸和氨。該酶廣泛存在于多種微生物中，但哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中沒(méi)有該種酶。因其具有的成為精氨酸缺陷型腫瘤如肝細(xì)胞瘤、黑色素瘤抗癌藥物的巨大潛力而被研究。
　　 肝細(xì)胞癌是現(xiàn)在世界上病發(fā)率最高的癌癥之一，每年新增一百萬(wàn)病例。近年來(lái)，精氨酸脫亞胺酶(ADI)的抗癌活性在國(guó)際上受到關(guān)注。美國(guó)食品藥品管理局(F

2、DA)，歐洲藥品審評(píng)署(EMEA)分別于1999年及2005年通過(guò)ADI-PEG-20作為罕見(jiàn)病藥物用于治療黑素瘤，肝細(xì)胞癌，目前三期臨床正在進(jìn)行中。本研究室通過(guò)篩選鑒定ADI產(chǎn)生菌株，并對(duì)該酶進(jìn)行定向改造以改良其在體內(nèi)生理?xiàng)l件下的酶活和酶學(xué)性質(zhì)，為開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗癌新藥提供酶源。
　　 通過(guò)建立一種ADI產(chǎn)生菌的篩選方法，得到一株產(chǎn)ADI的菌株SWP1。對(duì)該菌進(jìn)行形態(tài)、生理生化特征鑒定和16SrRNA基因序列分析，鑒定

3、該菌為變形假單胞菌。該菌現(xiàn)保藏于中國(guó)北京中關(guān)村中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心，保存號(hào)CGMCC No.2039，并己申請(qǐng)專利(一株產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶菌株及其應(yīng)用，專利號(hào)：200710107822.X)。
　　 構(gòu)建ADI編碼基因arcA的重組表達(dá)載體pET24a-ADI，在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得高效表達(dá)。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，確定在OD600達(dá)到1.0時(shí)加入0.2mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖

4、苷(IPTG),30℃誘導(dǎo)4h時(shí)酶活最高，為2.04U/mL發(fā)酵液。重組精氨酸脫亞胺酶(rADI)經(jīng)離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析后，得到電泳純的rADI。比酶活為20.85U/mg(pH6.0，37℃)，Km為2.88mmol/L，Vmax為31.68μmol/min/mg，最適反應(yīng)pH6.0。經(jīng)凝膠過(guò)濾分析，該酶分子量為92.6kDa，SDS-PAGE電泳顯示ADI條帶大小為46kDa，說(shuō)明重組精氨酸脫亞胺酶為同源二聚體。
　　

5、 研究表明，來(lái)源于變形假單胞菌Pseudomonas plecoglossicida CGMCC2039的重組ADI的最適反應(yīng)pH為6.0，在pH7.4（人體內(nèi)生理pH在7.4左右）時(shí)殘余酶活降低至10％以下；其Km（2.88mmol/L，pH6.0），高于人血清精氨酸濃度(100-120μM)20倍以上。因此，該精氨酸脫亞胺酶的高Km值及生理pH條件下酶活較低的性質(zhì)成為該酶抗癌活性研究的限制性因素。定向進(jìn)化技術(shù)是改造分子朝既定目標(biāo)進(jìn)化

6、的有力手段。基于改良的二乙酰一肟硫胺脲（測(cè)定瓜氨酸）方法，建立了簡(jiǎn)便靈敏的96孔板高通量篩選模型，用于獲得生理pH條件下具有高酶活和低Km值的精氨酸脫亞胺酶。通過(guò)一輪易錯(cuò)PCR，從650個(gè)突變株中篩選獲得一株優(yōu)良的突變株M314，其生理pH條件下比酶活(9.02U/mg)較出發(fā)菌株(0.44U/mg)提高20倍以上，Km值下降至0.65mmol/L(pH7.4)，最適pH從6.0提高至6.5。M314攜帶的三個(gè)突變位點(diǎn)分別為A128T,