銅綠假單胞菌內(nèi)在耐藥性相關(guān)基因的篩選及研究.pdf

1、二十世紀(jì)五十年代后,由于持續(xù)不合理的使用抗生素,臨床細(xì)菌的耐藥性現(xiàn)在已經(jīng)成為全球感染領(lǐng)域引人矚目的問題之一。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種革蘭氏陰性條件致病菌,主要在臨床中引起一定程度的感染。由于銅綠假單胞菌自身的特點(diǎn):如細(xì)胞本身對(duì)抗生素的通透性低,形成生物被膜等,賦予了銅綠假單胞菌特有的內(nèi)在抗藥性。正是由于銅綠假單胞菌抗藥性的出現(xiàn),使得對(duì)于銅綠假單胞菌感染的治療變得非常的棘手。因此,對(duì)于銅綠假單胞菌

2、內(nèi)在抗藥性的研究就變得至關(guān)重要。
　　 為了尋找銅綠假單胞菌中與抗生素抗性相關(guān)的基因,我們構(gòu)建了含有17000多個(gè)克隆的隨機(jī)轉(zhuǎn)座突變體庫,并用不同類型的七種抗生素對(duì)轉(zhuǎn)座突變體庫進(jìn)行了篩選。首先,在含有最小抑制濃度(Minimal Inhibitors Concentration,MIC)的固體平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)座突變體,被認(rèn)為是抗性轉(zhuǎn)座突變體。在1/2最小抑制濃度(MIC)的固體平板上不能生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)座突變體被認(rèn)為是敏感轉(zhuǎn)座突變體。然后

3、對(duì)固體平板篩選出來的轉(zhuǎn)座突變體在液體培養(yǎng)基中重新進(jìn)行一次篩選,并且確定每個(gè)轉(zhuǎn)座突變體各自的最小抑制濃度(MIC)。最終通過隨機(jī)PCR、測(cè)序和比對(duì),確定了轉(zhuǎn)座突變體庫中的43個(gè)轉(zhuǎn)座突變體的突變位點(diǎn)(即43個(gè)基因)。這些轉(zhuǎn)座突變體與野生型的銅綠假單胞菌相比較至少對(duì)一種抗生素的敏感程度發(fā)生了3倍或者3倍以上的變化。還有一些轉(zhuǎn)座突變體對(duì)三種抗生素都有3倍以上的變化,比如:PA4024、PA4342和PA4456的轉(zhuǎn)座突變體。有兩個(gè)轉(zhuǎn)座突變體對(duì)羧

4、芐青霉素的抗性提高了128倍。在這43個(gè)基因當(dāng)中,現(xiàn)已經(jīng)報(bào)道的與抗生素有關(guān)的基因有三個(gè),他們是PA0424(編碼多重耐藥操縱子的抑制蛋白MexR)、PA0426(編碼與抗生素抗性相關(guān)的RND外排泵的蛋白MexB；Resistance-Nodulation-CellDivision)和PA4207(編碼與抗生素抗性相關(guān)的RND外排泵的蛋白).而其它基因并未見其與抗生素抗性有關(guān)的報(bào)道。
　　 銅綠假單胞菌中被預(yù)測(cè)為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器的蛋白

5、很多?，F(xiàn)在已經(jīng)清楚的知道ATP依賴的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器在生物體中具有非常重要的作用。在我們篩選得到的結(jié)果中,PA4456被預(yù)測(cè)可能是ATP依賴的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器的組成部分,為了進(jìn)一步確定其基因的功能,我們對(duì)其進(jìn)行了深入的研究,如抗生素敏感性的測(cè)定,熒光分光光度法測(cè)定了細(xì)胞內(nèi)四環(huán)素的積累等。結(jié)果表明:(1)PA4456基因在細(xì)胞對(duì)四環(huán)索和有機(jī)溶劑的轉(zhuǎn)運(yùn)過程具有重要的功能；(2)PA4456突變體對(duì)氯霉素(Chloramphenicol)、氨甲氧嘧啶

6、(Trimethoprim)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)、二甲苯(Xylene)、二甲基甲酰胺(Dimethy-formamide)和甲苯(Toluene)的敏感性增加。
　　 為了了解其基因功能的調(diào)控機(jī)理,我們通過隨機(jī)轉(zhuǎn)座突變的方法從整個(gè)基因組水平篩選對(duì)PA44.56具有調(diào)節(jié)作用的基因,最終我們發(fā)現(xiàn)PA1180(phoQ)對(duì)PA4456具有潛在的抑制調(diào)節(jié)作用,在phoQ突變體中,PA4456的表達(dá)增加了8倍之多。<