抗人蛋白酶激活受體3單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、背景與目的:蛋白酶激活受體3(protease-activated receptor-3,PAR3)屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)家族成員,由細(xì)胞外區(qū)(N-末端和細(xì)胞外袢)、跨膜區(qū)(7個(gè)跨膜螺旋)及細(xì)胞內(nèi)區(qū)(細(xì)胞內(nèi)袢和C-末端)組成。PAR3存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等,廣泛分布在心臟,肝臟,胰腺,胸腺,小腸,胃,淋巴結(jié),氣管,腎上腺和骨髓等各種組織,參與炎癥、腫瘤等疾病。

2、制備hPAR3抗體,有利于檢測(cè)PAR3的表達(dá),深入了解其在疾病中的作用。鑒于我國(guó)國(guó)情,研制效價(jià)高,特異性好的PAR3單克隆抗體(mAb),具有重要意義。
　　方法:以hPAR3為免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤NS-1細(xì)胞融合。通過間接ELISA法篩選可特異性分泌抗hPAR3 mAb的雜交瘤細(xì)胞。采用Ig類與亞類鑒定試劑盒鑒定mAb的Ig亞類;通過ELISA、免疫組織化學(xué)染色、流式細(xì)胞分析、激光共聚焦掃描顯

3、微鏡、Dot blot等技術(shù)鑒定mAb的特異性。
　　結(jié)果:獲得2株可穩(wěn)定分泌抗hPAR3 mAb的雜交瘤細(xì)胞,其分泌的mAb均為IgM。免疫組化染色表明,mAb與肺中的巨噬細(xì)胞,結(jié)腸中的淋巴及疑似肥大細(xì)胞,扁桃體和包皮組織的淋巴細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)。流式細(xì)胞儀分析及激光共聚焦掃描顯微鏡觀察顯示,2株mAb與人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞上的PAR3呈陽(yáng)性反應(yīng)。Dot blot分析表明,其mAb能與轉(zhuǎn)印至NC膜上的PAR3Ag有效結(jié)合。