抗蛋白酶激活受體-4單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、背景與目的:Kahn和Xu于1998年成功克隆了PAR4基因,并從淋巴瘤Daudi細(xì)胞中得到了它的序列,全長(zhǎng)為4.9kb。其由385個(gè)氨基酸組成,和其它3種PARs有33％的同源性,細(xì)胞外包含一個(gè)推定的Arg/Gly絲氨酸蛋白酶切割位點(diǎn), Northernblot顯示PAR4的mRNA表達(dá)于人類的很多組織:肺臟上高表達(dá),胰臟,甲狀腺,睪丸及小腸亦表達(dá);熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示人的PAR4基因位于19p12染色體。但是PAR4在炎癥及其他疾病

2、中的確切作用及其機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究,因此我們制備廉價(jià)、有效的抗PAR-4mAb具有重要意義。
　　方法:以受Fmoc樹脂保護(hù)PAR-4特異性合成多肽(13肽)為免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤NS-1細(xì)胞融合。通過間接ELISA法篩選可特異性分泌抗PAR-4mAb的雜交瘤細(xì)胞;采用capture ELISA法鑒定mAb的Ig亞類;通過ELISA、Dot blot、免疫組織化學(xué)染色法、流式細(xì)胞分析、激光共

3、聚焦掃描顯微鏡技術(shù)鑒定mAb的特異性。
　　結(jié)果:結(jié)果:獲得3株可穩(wěn)定分泌抗PAR4mAb的雜交瘤細(xì)胞,其分泌的mAb均為IgM;免疫組化染色表明,mAb將人結(jié)腸組織中的腺上皮細(xì)胞、疑似肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,扁桃體中的淋巴細(xì)胞和包皮組織中的肥大細(xì)胞染成褐色;流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,3株mAb與A549細(xì)胞的PAR4均呈陽性反應(yīng);激光共聚焦掃描顯微鏡觀察,熒光標(biāo)記的陽性反應(yīng)物主要位于A549細(xì)胞的胞漿和胞膜上。
　　結(jié)論:成功地制備