胚胎干細(xì)胞在Lewis肺癌中的體內(nèi)外抗腫瘤作用研究.pdf

1、肺癌是當(dāng)今世界對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤，盡管采取一系列綜合治療手段，肺癌患者的生存率依然沒(méi)有得到明顯提高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，肺癌患者總的1年生存率低于30％，5年生存率低于16％。目前在臨床上廣泛采用的傳統(tǒng)治療方式如外科治療、化療和放療等治療效果不理想，即使近年來(lái)迅速發(fā)展的分子靶向治療和個(gè)體化治療等效果也不盡如人意，研究顯示導(dǎo)致這種結(jié)果的主要原因是由于肺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和治療后的局部復(fù)發(fā)，因此如果能發(fā)現(xiàn)一種既具有直接殺傷腫瘤作用，又能夠提高

2、患者機(jī)體免疫功能、消滅循環(huán)系統(tǒng)微轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的治療方法或藥物，無(wú)疑是肺癌患者的福音，而這些特點(diǎn)恰恰是腫瘤免疫治療的優(yōu)點(diǎn)所在。
　　 從免疫學(xué)角度而言，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是腫瘤與機(jī)體免疫系統(tǒng)之間相互作用的結(jié)果，機(jī)體的免疫系統(tǒng)是體內(nèi)一個(gè)功能強(qiáng)大而復(fù)雜的調(diào)控和執(zhí)行網(wǎng)絡(luò)，正常情況下具有明確抗原性的腫瘤細(xì)胞能被免疫識(shí)別并清除，然而腫瘤細(xì)胞通過(guò)在功能和結(jié)構(gòu)方面發(fā)生一系列變化，使其能夠逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和殺傷作用。例如，腫瘤細(xì)胞通過(guò)改變其表

3、面抗原的表達(dá)，使其免疫原性減弱，從而導(dǎo)致機(jī)體無(wú)法對(duì)其產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答;腫瘤細(xì)胞表面MHC分子缺失、表達(dá)下調(diào)或變異，導(dǎo)致抗原呈遞過(guò)程障礙，從而不能被細(xì)胞毒性淋巴T細(xì)胞(CTL)識(shí)別并進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)清除;多數(shù)腫瘤細(xì)胞協(xié)同刺激分子表達(dá)異常，導(dǎo)致細(xì)胞免疫中缺乏協(xié)同作用的第二信號(hào)傳遞，從而逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊;腫瘤負(fù)荷引起體內(nèi)的樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)功能缺陷，因而抗原呈遞能力變差，無(wú)法正常激活初始T細(xì)胞造成腫瘤的免疫耐受等;并且多數(shù)腫

4、瘤細(xì)胞在體內(nèi)能分泌多種免疫抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、唾液酸粘蛋白(sialomucin)和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophagemigration inhibitory factor，MIF)等，抑制體內(nèi)T細(xì)胞分化和分泌功能，破壞Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡狀

5、態(tài)，從而有利于腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)和增殖。在腫瘤免疫治療的臨床實(shí)踐中人們發(fā)現(xiàn)，正是由于腫瘤細(xì)胞表面抗原分子表達(dá)的改變、腫瘤本身對(duì)機(jī)體的免疫抑制作用以及腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的存在使其表面標(biāo)記和抗原能夠逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視，因而難以引發(fā)有效的免疫應(yīng)答。
　　 人們經(jīng)多年的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞在很多重要的生物學(xué)行為方面都有著非常驚人的相似性，例如兩者均具有快速增殖和分化能力、侵襲能力，并且能夠在一定程度上逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視，都在細(xì)胞

6、表面表達(dá)類似的細(xì)胞因子，細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)具有許多共同的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并且在基因和蛋白水平共有很多相似的表達(dá)產(chǎn)物，尤為重要的是兩者共同具有區(qū)別于成熟體細(xì)胞的、類似的細(xì)胞表面標(biāo)記/表面抗原。研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞及其衍生細(xì)胞來(lái)源的抗原，能夠在體內(nèi)有效激活CD4+和CD8+的T淋巴細(xì)胞，并且有研究證實(shí)，胚胎干細(xì)胞表面的MHC-Ⅰ類分子和其他蛋白抗原可以在體內(nèi)誘發(fā)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的、細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞的的免疫反應(yīng)。
　　 我們認(rèn)為這

7、種機(jī)體由于接種胚胎干細(xì)胞后誘導(dǎo)產(chǎn)生的穩(wěn)定而持久的免疫反應(yīng)，因?yàn)楸砻婵乖念愃?，可以交叉作用于腫瘤細(xì)胞，從而使機(jī)體具備了有效的抗腫瘤免疫，這為腫瘤的免疫治療打開(kāi)了新的思路。盡管當(dāng)時(shí)機(jī)制尚不明了，德國(guó)學(xué)者Sch(o)ne等曾研究指出，嚙齒類動(dòng)物經(jīng)接種早期胚胎組織可以明顯抑制移植性腫瘤的生長(zhǎng)。此后，經(jīng)過(guò)一系列研究人們發(fā)現(xiàn)這樣的現(xiàn)象，接種早期胚胎組織不僅可以抑制動(dòng)物體內(nèi)移植性腫瘤的生長(zhǎng)，還可以預(yù)防由于物理、化學(xué)等致癌因素導(dǎo)致的腫瘤發(fā)生，這種抗腫

8、瘤免疫作用對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展均具有明顯的抑制作用。而且最近的研究顯示，這種胚胎組織/胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫效應(yīng)具有廣譜的抗腫瘤作用，可能對(duì)多種腫瘤均具有顯著的抑制作用;并且，這種作用被證實(shí)并不是一種機(jī)體針對(duì)外來(lái)異物發(fā)生的“異物反應(yīng)”，人們推測(cè)其可能是由多種效應(yīng)細(xì)胞和細(xì)胞因子參與構(gòu)成的針對(duì)胚胎干細(xì)胞表面抗原的特異性免疫應(yīng)答。
　　 在另一方面，胚胎干細(xì)胞抗腫瘤作用的體外研究也取得了一系列令人驚喜的研究成果。例如，Raof和Po

9、stovit等的研究顯示胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)微環(huán)境具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞重新編程和良性轉(zhuǎn)化的作用，并且能夠在一定程度上抑制體內(nèi)局部腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移瘤的出現(xiàn);Giuffrida等研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞在體外環(huán)境中能夠分泌一些可溶性的抗腫瘤因子，具有抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的作用，并且能夠阻滯腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期;Lee等證實(shí)胚胎干細(xì)胞微環(huán)境能夠改變腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)方式，誘導(dǎo)惡性腫瘤獲得一定的良性表型，從而具有抗腫瘤作用;Kulesa等研究發(fā)現(xiàn)，胚胎神經(jīng)嵴發(fā)

10、育微環(huán)境能夠使高轉(zhuǎn)移黑色素瘤向正常表型轉(zhuǎn)化，惡性程度降低并表現(xiàn)為其起源細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)形狀;最近的研究結(jié)果表明，胚胎干細(xì)胞能在體外環(huán)境中誘導(dǎo)分化成為具有激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫作用的抗原呈遞細(xì)胞-樹(shù)突狀細(xì)胞，或者分化成為具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞作用的免疫效應(yīng)細(xì)胞，例如自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞等。
　　 本課題在總結(jié)前人研究工作經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，從體外和體內(nèi)兩方面深入研究胚胎干細(xì)胞在Lewis肺

11、癌中的抗腫瘤作用，并在整體、細(xì)胞和分子水平探索其抗腫瘤作用的具體作用機(jī)制:在體外研究中，通過(guò)建立胚胎干細(xì)胞-Lewis肺癌細(xì)胞體外非接觸式Transwell共培養(yǎng)體系，更直觀、更直接地觀察和檢測(cè)胚胎干細(xì)胞/胚胎干細(xì)胞微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，研究共培養(yǎng)條件下Lewis肺癌細(xì)胞的重要生物學(xué)行為改變，主要包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力特別是其成瘤能力等重要生物學(xué)行為的變化;在體內(nèi)研究中，通過(guò)構(gòu)建Lewis肺癌小鼠動(dòng)物模型并

12、模擬腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段，分別研究胚胎干細(xì)胞在預(yù)防移植性腫瘤的發(fā)生及腫瘤進(jìn)展中的治療作用兩方面的相關(guān)作用機(jī)制，并從整體水平、效應(yīng)細(xì)胞、細(xì)胞因子和腫瘤組織局部病理變化等多個(gè)方面探索胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)誘導(dǎo)抗腫瘤免疫過(guò)程中可能的作用機(jī)制和途徑，為肺癌的免疫治療和胚胎干細(xì)胞抗腫瘤作用研究開(kāi)辟新的研究領(lǐng)域，為肺癌的預(yù)防及治療帶來(lái)新的希望。
　　 第一部分胚胎干細(xì)胞抗Lewis肺癌作用的體外研究
　　 第一節(jié)胚胎干細(xì)胞對(duì)Lewis肺

13、癌細(xì)胞體外增殖的抑制作用
　　 研究目的:
　　 研究胚胎干細(xì)胞在體外細(xì)胞共培養(yǎng)條件下對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的抑制作用，探索胚胎干細(xì)胞體外抗腫瘤作用機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 通過(guò)建立C57/BL6小鼠胚胎干細(xì)胞-Lewis肺癌細(xì)胞體外Transwell非接觸式共培養(yǎng)體系，研究共培養(yǎng)條件下Lewis肺癌細(xì)胞的重要生物學(xué)行為改變，主要包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡，腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力以及細(xì)胞增殖水平的變化。<

14、br>　　 結(jié)果:
　　 Lewis肺癌細(xì)胞在與胚胎干細(xì)胞經(jīng)非接觸式共培養(yǎng)后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Lewis肺癌細(xì)胞體外增殖受到顯著抑制，大部分Lewis肺癌細(xì)胞周期被阻滯在G2/M期，凋亡的細(xì)胞數(shù)目明顯增多，并且腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯下降，結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 胚胎干細(xì)胞具有顯著的體外抗腫瘤作用，包括能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，阻滯腫瘤細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且明

15、顯改變腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力，在一定程度上抑制其惡性表型。
　　 第二節(jié)胚胎干細(xì)胞對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞成瘤能力的影響
　　 研究目的:
　　 研究Lewis肺癌細(xì)胞在與胚胎干細(xì)胞在體外共培養(yǎng)后對(duì)其成瘤能力影響，并探討這一過(guò)程中相關(guān)的作用機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 通過(guò)建立C57/BL6小鼠Lewis肺癌動(dòng)物模型，研究與胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)后Lewis肺癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力的改變，主要檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與

16、對(duì)照組小鼠皮下移植性腫瘤體積和重量的變化，并通過(guò)TUNEL方法檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 經(jīng)與胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)后，Lewis肺癌細(xì)胞的成瘤能力顯著下降，主要表現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組小鼠皮下腫瘤體積的增大和重量的增加均受到顯著的抑制，并且實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤組織中細(xì)胞凋亡的程度明顯增加，結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 胚胎干細(xì)胞在體外共培養(yǎng)過(guò)程中能夠明顯抑制Lew

17、is肺癌細(xì)胞的成瘤能力，顯著抑制其在體內(nèi)實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加，成瘤能力作為典型的惡性表型受到抑制，這種作用可能與胚胎干細(xì)胞能夠在體外抑制Lewis肺癌細(xì)胞群體中腫瘤干細(xì)胞的活性有關(guān)。
　　 第二部分胚胎干細(xì)胞抗Lewis肺癌作用的體內(nèi)研究
　　 第一節(jié)胚胎干細(xì)胞對(duì)Lewis肺癌發(fā)生的預(yù)防作用研究
　　 研究目的:
　　 研究實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)接種胚胎干細(xì)胞后，誘導(dǎo)體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制，及其對(duì)

18、腫瘤發(fā)生的預(yù)防作用。
　　 研究方法:
　　 將γ射線滅活的胚胎干細(xì)胞經(jīng)皮下注射進(jìn)入C57/BL6小鼠體內(nèi)完成免疫接種，在重復(fù)接種3次后檢測(cè)小鼠免疫指標(biāo)水平，主要通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞（CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞）數(shù)量及比例、ELISA檢測(cè)血清細(xì)胞因子(IL-2、IL4和IFN-γ)水平，接種Lewis肺癌細(xì)胞后，監(jiān)測(cè)小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，待動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)

19、胞增殖情況，剝離腫瘤組織、秤重并制作組織切片，IHC檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)CTL淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度，TUNEL檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 與對(duì)照組相比，經(jīng)胚胎干細(xì)胞免疫接種的實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血CD3+/CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值和比例明顯升高、血清Th1型抗腫瘤細(xì)胞因子(IL-2和IFN-γ)水平顯著升高，脾臟T淋巴細(xì)胞增殖顯著，腫瘤發(fā)生率明顯降低(P＜0.05);即使在有腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)組小鼠，其實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)速度受

20、到顯著抑制，病理學(xué)顯示其腫瘤組織CTL淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，腫瘤組織內(nèi)部細(xì)胞凋亡具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 接種胚胎干細(xì)胞能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生顯著的抗腫瘤預(yù)防作用，小鼠體內(nèi)抗腫瘤細(xì)胞免疫水平明顯提高，能夠有效地抑制小鼠移植性腫瘤的發(fā)生。
　　 第二節(jié)胚胎干細(xì)胞對(duì)Lewis肺癌進(jìn)展的治療作用研究
　　 研究目的:
　　 研究胚胎干細(xì)胞在小鼠腫瘤模型中誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制，

21、及其對(duì)腫瘤發(fā)展的治療作用。
　　 研究方法:
　　 采用C57/BL6小鼠皮下接種Lewis肺癌細(xì)胞建立腫瘤動(dòng)物模型，并利用接種時(shí)間的長(zhǎng)短和皮下瘤塊的生長(zhǎng)情況模擬不同的腫瘤發(fā)展時(shí)期，將γ射線滅活的胚胎干細(xì)胞經(jīng)皮下注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)（共3次間隔7天）進(jìn)行免疫治療，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量和比例變化、ELISA檢測(cè)血清細(xì)胞因子水平，監(jiān)測(cè)皮下腫瘤生長(zhǎng)情況并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，待動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剝離腫瘤組織稱重，通過(guò)I

22、HC檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞增殖情況和腫瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度，TUNEL檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 在腫瘤模型小鼠中接種胚胎干細(xì)胞能夠刺激機(jī)體CD3+/CD8+T淋巴細(xì)胞增殖，血清Th1型抗腫瘤細(xì)胞因子（IL-2和IFN-γ）水平顯著升高(P＜0.05)，荷瘤鼠的免疫抑制狀態(tài)得到改善，實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)得到顯著抑制，病理學(xué)顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖明顯增多，腫瘤組織局部有更多CTL淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腫瘤細(xì)胞凋亡程