化合物6r體內(nèi)外抗腫瘤活性及作用機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 依他尼酸(EA)是一種谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTπ）抑制劑，具有較弱的抗腫瘤活性。但由于EA生物利用度低，副作用大，限制了其在臨床的進一步應用。根據(jù)生物等電子重排原理，我們設計并合成了一系列EA噁二唑衍生物，通過篩選，發(fā)現(xiàn)化合物5-[2，3-二氯-4-(2-亞甲基-1-代丁基)氯苯]-3．甲基．1，2，4．噁二唑(6r)具有較高的抗腫瘤活性，具有進一步研究成為抗腫瘤藥物的價值。
　　 實驗方法：
　　

2、 體外實驗:MTT法評價化合物6r對一系列腫瘤細胞增殖的抑制作用，并選取敏感細胞株人結(jié)腸癌SW620細胞及人前列腺癌PC3細胞進一步研究。Hoechst33258染色法，F(xiàn)ITC-AnnexinV/PI雙染法檢測6r對腫瘤細胞凋亡的影響;碘化丙啶(PI)單染法檢測6r對腫瘤細胞周期的影響。Westernblotting法檢測6r對腫瘤細胞中GSTπ，EGFR，PI3K/Akt信號通路分子及周期蛋白CyclinD1表達水平的影響。

3、>　　 體內(nèi)實驗:分別構(gòu)建裸鼠皮下接種結(jié)腸癌SW620細胞移植瘤，皮下接種前列腺癌PC3細胞移植瘤以及原位接種標靶熒光素酶基因前列腺癌PC-3M-Luc-C6細胞移植瘤模型，以6r治療組，5．氟尿嘧啶(5-Fu)或米托蒽醌(Mitoxantrone，MA)陽性對照組及溶劑陰性對照組進行裸鼠實驗。采用尾靜脈方式給藥，隔天給藥并連續(xù)給藥數(shù)周。實驗結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤并稱重，通過與陰性對照組比較評價6r體內(nèi)抗腫瘤活性。Westernb

4、lotting法檢測6r對腫瘤組織中GSTπ，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，bcl-2/Bax，Cyt-C及EGFR/PI3K/Akt表達的影響。
　　 實驗結(jié)果：
　　 體外實驗結(jié)果:體外生長抑制試驗結(jié)果表明，6r對大多數(shù)腫瘤細胞具有較強的抑制作用，對SW620及PC3腫瘤細胞半抑制率IC50分別為4.89μtM和3.79μM，選取敏感腫瘤細胞株P(guān)C3及SW620進一步實驗。Hoechst33258染色結(jié)果顯示，2μ

5、M，4μM6r可明顯誘導腫瘤細胞凋亡。熒光顯微鏡觀察，SW620及PC3細胞核染色質(zhì)濃染，固縮或聚核膜周邊，或呈塊狀碎裂改變。FITC-AnnexinV/PI雙染法試驗結(jié)果表明，4μM6r處理SW620及PC3腫瘤細胞24h凋亡率分別為28.8％和29.41％。PI單染法實驗結(jié)果表明，4μM6r處理SW620細胞，處于S期的細胞數(shù)比例顯著增加至66.85％;8μM6r處理PC3細胞，處于S期的細胞數(shù)比例顯著增加至22.79％，證明6r可

6、阻滯腫瘤細胞周期于S期。Westernblotting結(jié)果顯示，6r對SW620細胞及腫瘤組織中GSTπ的表達無明顯影響，8μM6r可顯著增加抑制PC3細胞中EGFR/PI3K/Akt及CyclinD1的表達水平。
　　 體內(nèi)實驗結(jié)果:裸鼠移植瘤實驗中，與陰性對照組比較，以8mg/kg劑量尾靜脈注射給藥3周后，6r對結(jié)腸癌SW620皮下移植瘤生長抑制率為44.17％;給藥3周后，6r對前列腺癌PC3皮下移植瘤的生長抑制率為63.

7、3％;給藥4周后，對原位前列腺癌PC-3M細胞移植瘤抑制率為60.5％，且無明顯副作用。動物實驗結(jié)果證明6r具有較強的體內(nèi)抗腫瘤活性。Westernbolotti(n)g結(jié)果顯示，6r對SW620腫瘤組織中GSTπ的表達無明顯影響。6r可顯著增加裸鼠腫瘤組織中cleaved-caspase-3的表達水平，促進線粒體內(nèi)細胞色素C的釋放，增加Bax的表達而下調(diào)bcl-2的表達，使兩者比例降低，抑制EGFR/PI3K/Akt蛋白的表達。