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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景:
依他尼酸(EA)是一種谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSTπ)抑制劑,具有較弱的抗腫瘤活性。但由于EA生物利用度低,副作用大,限制了其在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用。根據(jù)生物等電子重排原理,我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了一系列EA噁二唑衍生物,通過(guò)篩選,發(fā)現(xiàn)化合物5-[2,3-二氯-4-(2-亞甲基-1-代丁基)氯苯]-3.甲基.1,2,4.噁二唑(6r)具有較高的抗腫瘤活性,具有進(jìn)一步研究成為抗腫瘤藥物的價(jià)值。
實(shí)驗(yàn)方法:
2、 體外實(shí)驗(yàn):MTT法評(píng)價(jià)化合物6r對(duì)一系列腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用,并選取敏感細(xì)胞株人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞及人前列腺癌PC3細(xì)胞進(jìn)一步研究。Hoechst33258染色法,F(xiàn)ITC-AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)6r對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響;碘化丙啶(PI)單染法檢測(cè)6r對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響。Westernblotting法檢測(cè)6r對(duì)腫瘤細(xì)胞中GSTπ,EGFR,PI3K/Akt信號(hào)通路分子及周期蛋白CyclinD1表達(dá)水平的影響。
3、> 體內(nèi)實(shí)驗(yàn):分別構(gòu)建裸鼠皮下接種結(jié)腸癌SW620細(xì)胞移植瘤,皮下接種前列腺癌PC3細(xì)胞移植瘤以及原位接種標(biāo)靶熒光素酶基因前列腺癌PC-3M-Luc-C6細(xì)胞移植瘤模型,以6r治療組,5.氟尿嘧啶(5-Fu)或米托蒽醌(Mitoxantrone,MA)陽(yáng)性對(duì)照組及溶劑陰性對(duì)照組進(jìn)行裸鼠實(shí)驗(yàn)。采用尾靜脈方式給藥,隔天給藥并連續(xù)給藥數(shù)周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,處死裸鼠,取出腫瘤并稱重,通過(guò)與陰性對(duì)照組比較評(píng)價(jià)6r體內(nèi)抗腫瘤活性。Westernb
4、lotting法檢測(cè)6r對(duì)腫瘤組織中GSTπ,凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3,bcl-2/Bax,Cyt-C及EGFR/PI3K/Akt表達(dá)的影響。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果:體外生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果表明,6r對(duì)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用,對(duì)SW620及PC3腫瘤細(xì)胞半抑制率IC50分別為4.89μtM和3.79μM,選取敏感腫瘤細(xì)胞株P(guān)C3及SW620進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。Hoechst33258染色結(jié)果顯示,2μ
5、M,4μM6r可明顯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。熒光顯微鏡觀察,SW620及PC3細(xì)胞核染色質(zhì)濃染,固縮或聚核膜周邊,或呈塊狀碎裂改變。FITC-AnnexinV/PI雙染法試驗(yàn)結(jié)果表明,4μM6r處理SW620及PC3腫瘤細(xì)胞24h凋亡率分別為28.8%和29.41%。PI單染法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,4μM6r處理SW620細(xì)胞,處于S期的細(xì)胞數(shù)比例顯著增加至66.85%;8μM6r處理PC3細(xì)胞,處于S期的細(xì)胞數(shù)比例顯著增加至22.79%,證明6r可
6、阻滯腫瘤細(xì)胞周期于S期。Westernblotting結(jié)果顯示,6r對(duì)SW620細(xì)胞及腫瘤組織中GSTπ的表達(dá)無(wú)明顯影響,8μM6r可顯著增加抑制PC3細(xì)胞中EGFR/PI3K/Akt及CyclinD1的表達(dá)水平。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中,與陰性對(duì)照組比較,以8mg/kg劑量尾靜脈注射給藥3周后,6r對(duì)結(jié)腸癌SW620皮下移植瘤生長(zhǎng)抑制率為44.17%;給藥3周后,6r對(duì)前列腺癌PC3皮下移植瘤的生長(zhǎng)抑制率為63.
7、3%;給藥4周后,對(duì)原位前列腺癌PC-3M細(xì)胞移植瘤抑制率為60.5%,且無(wú)明顯副作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明6r具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤活性。Westernbolotti(n)g結(jié)果顯示,6r對(duì)SW620腫瘤組織中GSTπ的表達(dá)無(wú)明顯影響。6r可顯著增加裸鼠腫瘤組織中cleaved-caspase-3的表達(dá)水平,促進(jìn)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放,增加Bax的表達(dá)而下調(diào)bcl-2的表達(dá),使兩者比例降低,抑制EGFR/PI3K/Akt蛋白的表達(dá)。
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