先天性巨結(jié)腸腸神經(jīng)系統(tǒng)及血清中Neuroligin基因與谷氨酸的表達(dá)和意義.pdf

1、目的:作為一種常見的消化道先天性畸形和典型的腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常性疾病，先天性巨結(jié)腸(Hischsprung's disease，HD)的大體病理改變主要為病變腸段腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的缺如，病變腸管痙攣狹窄，病變腸段近端的結(jié)腸由于蠕動(dòng)加強(qiáng)而代償性肥厚擴(kuò)大，最終引起巨結(jié)腸的發(fā)生。臨床上以嘔吐、腹脹、便秘為主要表現(xiàn)，可出現(xiàn)腸梗阻、腸穿孔以及小腸結(jié)腸炎等并發(fā)癥，嚴(yán)重者會(huì)危及生命。雖然關(guān)于其病因研究的學(xué)說有很多，但都不能完全解釋其發(fā)病機(jī)制。在常見的基因

2、異常學(xué)說中，與HD密切相關(guān)的RET等許多基因（SOX10基因、ECE1基因等）的突變只在大約50％的家族性病例患兒和7％到35％的散發(fā)病例患兒中發(fā)現(xiàn)，所以這種學(xué)說無法全面地解釋HD的發(fā)病機(jī)制;腸道微環(huán)境異常學(xué)說認(rèn)為細(xì)胞外基質(zhì)成分的過度增多，導(dǎo)致了腸神經(jīng)嵴細(xì)胞由于過早分化、成熟、粘附、聚集而無法正常遷移達(dá)到結(jié)腸遠(yuǎn)端導(dǎo)致了該消化道畸形的發(fā)生，然而有研究發(fā)現(xiàn)盡管在HD患兒痙攣段腸管中未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)節(jié)絀胞，但在其盆腔神經(jīng)叢支配的膀胱、前列腺等臟器內(nèi)

3、卻發(fā)現(xiàn)了正常的的神經(jīng)節(jié)絀胞，故僅用腸道微環(huán)境的異常解釋導(dǎo)致腸神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移的停止而導(dǎo)致HD發(fā)生也是不全面的;此外還有腸道Cajal間質(zhì)起搏細(xì)胞(inters titial cells of cajal，ICC)異常學(xué)說認(rèn)為ICC數(shù)量的減少和網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)的破壞與HD關(guān)系密切，由于ICC的異常導(dǎo)致腸道起搏功能的障礙，使腸道慢波活動(dòng)喪失，導(dǎo)致HD的發(fā)病。但是同時(shí)也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)有些HD病例的無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段中ICC的分布及數(shù)量與正常腸管并無太大差異。

4、所以這種單一的理論也無法完全闡釋HD的發(fā)病機(jī)理。這些學(xué)說都只是在某一方面說明一部分病人的發(fā)病機(jī)制，不能形成一套統(tǒng)一全面的基礎(chǔ)理論。而由于基礎(chǔ)理論的不確定，導(dǎo)致對(duì)該病的診斷、鑒別以及分型都存在一定的局限和困難。
　　本研究擬從神經(jīng)系統(tǒng)突觸發(fā)育異常的角度，討論已經(jīng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System，CNS)中研究地較為深入的突觸后跨膜吸附蛋白的編碼基因Neuroligin基因及相應(yīng)的突觸后跨膜吸附蛋白Neur

5、oligins蛋白在HD腸神經(jīng)系統(tǒng)(Enteric Nervous System，ENS)中肌間神經(jīng)叢Cajal間質(zhì)細(xì)胞(inters titial cellsof cajal within the myenefic region，ICC-MY)的表達(dá)情況，并進(jìn)一步研究Neuroligin-1蛋白亞型及其相關(guān)的谷氨酸(Glutamate，Glu)在HD病人腸管ENS中和血液中的表達(dá)，從ENS突觸功能異常的角度討論Neuroligin基因

6、及Glu的表達(dá)和變化與HD發(fā)病的關(guān)系，進(jìn)而探討其對(duì)HD發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐的意義。
　　方法:腸管和血液標(biāo)本取自2010年至2013年間山東大學(xué)齊魯醫(yī)院小兒外科收治的90例病理診斷為HD的患兒（短段型50例，長(zhǎng)端型40例），另取50例腹股溝斜疝患兒(indirect inguinal hernia，ⅡH)的血液標(biāo)本作為對(duì)照。為減小研究誤差，我們控制入選研究的各組患兒的年齡、基礎(chǔ)代謝率以及營養(yǎng)狀況（包括身長(zhǎng)、體重、血清總蛋白

7、、血清白蛋白、血紅蛋白、血尿素氮等等）之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　收集HD切除腸管的狹窄段（無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段）、移行段和擴(kuò)張段近端（正常段、有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段）。部分新鮮組織置于-80℃儲(chǔ)存用于Western-blot和qRT-PCR，進(jìn)行Neuroligin-1，2，3，4(Neuroligins)、Neuroligin-1和Glu的定量分析和比較;部分組織制備腸肌間神經(jīng)叢鋪片(Longitudinal muscle with adher

8、entmyenteric plexus，LMMP)用于免疫化學(xué)染色研究Neuroligins、Neuroligin-1和Glu在ENS的表達(dá)情況和ICC-MY的分離培養(yǎng);部分組織制備石蠟切片用于免疫組化染色研究Neuroligin-1的表達(dá)情況;免疫磁珠分選(Magnetic-activated CellSorting，MACS)和流式絀胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)用于ICC-MY的分選和計(jì)數(shù)。
　　收集HD和ⅡH

9、患兒的血清，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，使用ELISA技術(shù)檢測(cè)各自的血清Glu含量并通過進(jìn)行長(zhǎng)段型HD、短段型HD和非HD之間的比較研究其對(duì)HD診斷、鑒別以及臨床分型的重要意義。
　　數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組數(shù)據(jù)組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，三組數(shù)據(jù)之間兩兩比較采用單因素方差分析和Turkey's檢驗(yàn)進(jìn)行分析。使用SPSS11.5和GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:

10、(1)對(duì)LMMP進(jìn)行免疫組化染色證實(shí)ICC-MY表達(dá)于LMMP，細(xì)胞之間相互聯(lián)系從而構(gòu)成網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，且該網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)在無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段和有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段之間并無明顯差異。(2)對(duì)LMMP進(jìn)行雙重免疫熒光染色證實(shí)Neuroligin-1，2，3，4蛋白表達(dá)于ICC-MY，且Neuroligins蛋白在無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段構(gòu)成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)不完整，說明Neuroligins蛋白在無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段表達(dá)減少。(3)以新鮮LMMP分離培養(yǎng)細(xì)胞后，通過MACS純化分

11、選出ICC-MY，并使用FCM進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，證實(shí)雖然分選出的ICC-MY細(xì)胞數(shù)由擴(kuò)張段近端到移行段再到狹窄段逐漸減少，但三組細(xì)胞中含有的ICC-MY比例并無明顯差異。(4)使用細(xì)胞免疫熒光染色對(duì)分選出的細(xì)胞進(jìn)行染色，證實(shí)為梭形和紡錘形的ICC-MY。(5)以ICC-MY的特異性抗體C-kit為參考，使用Western-blot技術(shù)對(duì)來自狹窄段、移行段、擴(kuò)張段近端的細(xì)胞中的Neuroligins蛋白進(jìn)行分析，證實(shí)Neuroligins蛋白

12、的表達(dá)量由擴(kuò)張段近端到移行段再到狹窄段逐漸降低。(6)雙重免疫熒光技術(shù)顯示Neuroligin-1蛋白和Glu在LMMP表達(dá)于同一部位且在無神經(jīng)細(xì)胞段的表達(dá)少于有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段。(7)免疫組化顯示，Neuroligin-1蛋白在石蠟切片的表達(dá)由擴(kuò)張段近端到移行段再到狹窄段逐漸減少，Glu在LMMP的表達(dá)也由擴(kuò)張段近端到移行段再到狹窄段逐漸減少。(8)Western-blot和qRT-PCR顯示Neuroligin-1和Glu的表達(dá)由擴(kuò)張段

13、近端到移行段再到狹窄段逐漸減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與免疫化學(xué)顯示結(jié)果相符。(9)ELISA檢測(cè)血清Glu顯示，由長(zhǎng)段型HD到短段型HD再到非HD，血清Glu的含量逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:通過上述實(shí)驗(yàn)和所得到的結(jié)果我們可以得到以下結(jié)論:(1) Neuroligins蛋白表達(dá)于HD患兒ENS中的ICC-MY，其表達(dá)量由狹窄段到移行段再到擴(kuò)張段近端的變化可能會(huì)導(dǎo)致ICC-MY突觸功能的異常，突觸功能的異常會(huì)進(jìn)而影響ENS

14、中神經(jīng)沖動(dòng)和神經(jīng)信號(hào)的傳遞，繼而導(dǎo)致由ICC-MY引發(fā)的腸道起搏功能受損，使得病變段的腸管喪失蠕動(dòng)功能，最終導(dǎo)致HD的發(fā)生。(2)Neuroligin-1蛋白亞型和與其密切相關(guān)的Glu在HD患兒的ENS同一部位表達(dá)，這不僅可能作為ENS中神經(jīng)元，特別是興奮性神經(jīng)后突觸的新的分子標(biāo)記，其表達(dá)量由狹窄段到移行段再到擴(kuò)張段近端的變化也可能會(huì)通過引發(fā)興奮性突觸后功能的異常進(jìn)而導(dǎo)致腸道舒縮異常最終形成了HD的發(fā)生。(3)血清Glu含量的檢測(cè)以及其