先天性巨結(jié)腸患者SEMA 3C-SEMA 3D基因突變在腸神經(jīng)系統(tǒng)中的作用機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:先天性巨結(jié)腸(HSCR)是一種多基因改變導致的遺傳性先天性疾病,其基本病理特征為病變腸段神經(jīng)節(jié)細胞缺失伴神經(jīng)纖維排列紊亂,以致受累腸段持續(xù)異常收縮而近端結(jié)腸代償性擴張,形成巨結(jié)腸?,F(xiàn)已明確HSCR是一種神經(jīng)嵴細胞源性疾病,多種因素均可影響神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育,其中軸突導向因子Semaphorin3(SEMA3)家族分子是一類表達于脊椎動物的分泌型蛋白,主要通過調(diào)節(jié)突觸形成、軸突修剪、樹突棘的密度和成熟等來調(diào)控神經(jīng)元的遷移、增殖、分化甚

2、至凋亡。既往研究證實HSCR患者攜帶有SEMA3C/3D基因罕見突變,很可能參與HSCR發(fā)病。
  目的:探索SEMA3C/3D突變蛋白對神經(jīng)細胞軸突生長、遷移、分化和成熟的影響及其在分子水平的作用機制,進一步闡明先天性巨結(jié)腸的復(fù)雜發(fā)病機制。
  方法:
  1.分別用野生型(WT)和突變型(S329G SEMA3C、V337MSEMA3C、H424Q SEMA3C、V457I SEMA3D、P615T SEMA3D)

3、 SEMA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞獲取含融合蛋白的上清液,經(jīng)底物顯色法定量后,再用含0.5nm/ml相應(yīng)蛋白的野生型和突變型上清液分別處理Neuro-2a細胞1h,收集處理后的細胞先用免疫熒光染色法檢測細胞骨架的形態(tài)變化,再用Transwell遷移實驗檢測其遷移功能,同時提取處理后的細胞總蛋白用Western blot法檢測cofilin、ERM、CRMP2各蛋白表達水平及其重要位點磷酸化水平變化情況。
  2.建立胎鼠腸神經(jīng)

4、嵴細胞(ENCC)原代培養(yǎng)的技術(shù)方法,用含0.5nm/ml相應(yīng)蛋白的野生型和突變型上清液分別處理細胞72h,再用含5%胎牛血清的促分化培養(yǎng)基孵育7d后,收集細胞先用特異性標志物多重免疫熒光染色法檢測ENCC的分化傾向和神經(jīng)元成熟度,再用Transwell遷移實驗檢測其遷移能力。
  結(jié)果:
  1.與WT SEMA3D組相比,P615T SEMA3D作用下的Neuro-2a細胞的p-cofilin蛋白表達水平明顯降低,而其他

5、蛋白(cofilin、ERM、p-ERM、CRMP2、p-CRMP2)的表達水平均沒有統(tǒng)計學差異。與WT組相比,其他突變型SEMA3C/3D作用下的Neuro-2a細胞各蛋白表達水平也沒有統(tǒng)計學差異。
  2.與空載對照組相比,WT SEMA3C/3D作用下的Neuro-2a細胞有收縮的趨勢,但軸突和樹突/樹突棘排列整齊、結(jié)構(gòu)完整;而突變型SEMA3C/3D作用下的Neuro-2a細胞明顯收縮,軸突和樹突/樹突棘彎曲纏繞、排列紊亂

6、,軸突生長錐塌陷,更嚴重的是部分細胞骨架蛋白斷裂,失去正常的細胞結(jié)構(gòu)。
  3.與空載對照組相比,WT SEMA3C組的Neuro-2a細胞遷移率明顯增加,與WT組相比,突變組(S329G SEMA3C、V337M SEMA3C、P615T SEMA3D)的細胞遷移率明顯降低。
  4.與空載對照組相比,WT SEMA3C作用下的ENCC分化為神經(jīng)元/成熟神經(jīng)元的能力均明顯增強;與WT相比,突變型SEMA3C作用下的ENCC

7、分化為神經(jīng)元/成熟神經(jīng)元的能力均有下降的趨勢,其中以V337M SEMA3C處理組的下降最為明顯。而在SEMA3D處理組中,WT和突變型SEMA3D作用下的ENCC分化為神經(jīng)元/成熟神經(jīng)元的能力均沒有統(tǒng)計學意義上的差異。
  5.SEMA3C/3D各處理組中的ENCC神經(jīng)球均可以穿過Transwell小室的基底膜,其遷移能力沒有明顯差異。
  結(jié)論:
  1.P615T SEMA3D可通過下調(diào)p-cofilin蛋白表達

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