超低溫保存角膜緣上皮細(xì)胞的生物活性及超微結(jié)構(gòu)中細(xì)胞凋亡研究.pdf

1、眼表面疾病是眼科常見病，其中許多疾病都存在角膜緣干細(xì)胞缺陷或功能障礙，治療也相當(dāng)棘手。直到1986年，Schermer等首次證實了角膜干細(xì)胞定位于角膜緣基底層的設(shè)想。基于角膜緣干細(xì)胞的新概念，近10年來眼表面重建研究集中于角膜緣部上皮細(xì)胞，成為當(dāng)今國際眼科研究熱點之一。自體角膜緣上皮移植已在臨床上廣泛開展并獲得良好的療效。然而，由于自體取材很多情況下受限，如雙眼同時存在角膜緣干細(xì)胞缺陷，同種異體角膜緣上皮移植和以體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞移

2、植是最新的研究目標(biāo)。進而，供體材料的保存也成為人們關(guān)注的焦點。超低溫(-196℃)冷凍保存法的優(yōu)勢是保存時間長，降低抗原性，保證供體材料隨需隨取和臨床移植手術(shù)的計劃性，并為組織配型提供時間上的保障。超低溫冷凍保存方法已成功地應(yīng)用于角膜的保存，但保存的關(guān)鍵是維持角膜內(nèi)皮細(xì)胞的活性。那么，該保存方法是否也適合于角膜緣上皮的長期保存呢?適宜的冷凍條件如何?冷凍保存組織復(fù)溫后，上皮細(xì)胞活性和超微結(jié)構(gòu)有無改變?角膜緣干細(xì)胞對超低溫的耐受性怎樣?冷

3、凍是否能誘導(dǎo)干細(xì)胞凋亡?有關(guān)這些問題，目前國內(nèi)外文獻中尚無報道。 角膜緣干細(xì)胞是角膜上皮更新的源泉。迄今，證實該干細(xì)胞的存在都是間接證據(jù)，尚無直接定性的免疫學(xué)和形態(tài)學(xué)標(biāo)志。但近年來許多研究表明，體外培養(yǎng)的原代角膜緣上皮細(xì)胞屬未分化細(xì)胞，具有干細(xì)胞的特性，因此，在研究中可把原代細(xì)胞看作是干細(xì)胞。透射電鏡下，核大深染、胞漿少和細(xì)胞器缺乏的角膜緣基底細(xì)胞，被公認(rèn)為是干細(xì)胞。基于以上觀點，本研究先從不同冷凍復(fù)溫條件對角膜緣表層上皮細(xì)胞活

4、性的影響人手；再通過原代細(xì)胞培養(yǎng)，探討角膜緣干細(xì)胞的冷凍復(fù)溫后增殖特點；其次通過器官培養(yǎng)，探討表皮生長因子對角膜緣全層上皮細(xì)胞的增殖活性影響；最后通過超微結(jié)構(gòu)的研究，探討角膜緣干細(xì)胞在冷凍后凋亡情況。通過以上系列體外實驗研究，探討超低溫冷凍保存對角膜緣上皮細(xì)胞的影響，為今后的進一步實驗研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方 法 論文一： 1．冷凍復(fù)溫條件的設(shè)定：冷凍保護劑選用二甲基亞楓(DMSO)，按照不同濃

5、度和梯度分為5組。降溫方法：按照不同的降溫速率分為4組，其中3組為程序降溫，另1組為非程序降溫(直接移人液氮)。復(fù)溫條件：按照不同的熱傳導(dǎo)介質(zhì)和溫度分為4組。液氮中(一196℃)保存時間1月～1年。 2．采用臺盼藍(lán)和茜素紅套染方法，對角膜緣表層上皮細(xì)胞的平均存活率(SESR)和形態(tài)進行對比研究。 論文二： 1．冷凍條件設(shè)定：按照冷凍保護劑濃度和梯度不同，分為3組；按照降溫條件不同分為2組；復(fù)溫條件為37℃水浴

6、。并和新鮮組織同時做對照觀察。 2．角膜緣上皮細(xì)胞培養(yǎng)：按照培養(yǎng)基中是否加入血清，分為兩大組：血清培養(yǎng)法和無血清培養(yǎng)法。每組中，分別對消化培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法進行對比研究。血清培養(yǎng)法中，對RPMI一1640、MEM、DMEM 3種培養(yǎng)基進行比較；在無血清培養(yǎng)中，對小鼠3T3細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞2種滋養(yǎng)層進行比較。 3．采用相差顯微鏡對培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點和形態(tài)做記錄和照相觀察。 4．若丹明一B染色實驗：采

7、用若丹明染色方法對原代細(xì)胞的增殖能力進行定量測定。 論文三： 1．冷凍條件設(shè)定：1種濃度梯度DMSO，1℃/Min的降溫速率，37℃水浴復(fù)溫。 2．角膜緣上皮組織的器官培養(yǎng)：培養(yǎng)液中加入不同濃度的表皮生長因子(EGF)。3．角膜緣上皮細(xì)胞的增殖核抗原(PCNA)表達(dá)：采用SABC免疫組織化學(xué)染色法。 論文四： 1．冷凍條件設(shè)定：同論文三。 2．器官培養(yǎng)不同時間的角膜緣上皮細(xì)胞做透射電

8、鏡觀察。 3．觀察角膜緣上皮基底層和中間層出現(xiàn)凋亡細(xì)胞的時間。 結(jié) 果 論文一： 1．冷凍保護劑的影響：4種濃度梯度DMSO做冷凍保護劑組的角膜緣表層上皮細(xì)胞SESR最高，與其它4組有顯著性差異(p<0.01)；無冷凍保護劑組SESR最低。 2．降溫方法的影響：程序降溫組的角膜緣表層上皮細(xì)胞的SESR高于非程序降溫，差異有顯著性(p<0.01)；程序降溫組中，1.0℃/rain、5.

9、0℃/min、10.0℃/min的降溫速率的角膜緣表層上皮細(xì)胞SESR無顯著性差異(p>0.05)。 3．復(fù)溫方法的影響：60℃和37℃水浴中復(fù)溫組的角膜緣上皮細(xì)胞SESR無顯著性差異(p>0.05)，但均高于18℃水浴組和室溫空氣組(p<0.001)。 4．保存時間的影響：貯存1個月至1年的材料，其SESR無顯著性差異(p>0.05)。 論文二： 1．細(xì)胞生長特點及形態(tài)：程序降溫保存的角膜緣上皮細(xì)胞易于

10、血清培養(yǎng)中生長，細(xì)胞為多邊形或不規(guī)則形，融合為單層；而在無血清培養(yǎng)基中生長緩慢，細(xì)胞為長條形或梭形。消化培養(yǎng)法的冷凍角膜緣上皮細(xì)胞，在血清培養(yǎng)和無血清培養(yǎng)基中均不易貼壁生長；而組織塊培養(yǎng)法的細(xì)胞呈膜狀生長，易融合成單層。非程序降溫(直接移人液氮)保存的角膜緣上皮亦能貼壁生長，但貼壁時間較晚，細(xì)胞大小不一，形態(tài)多樣。 2．細(xì)胞增殖能力： 1)冷凍保護劑的影響：采用1種和4種濃度DMSO冷凍保存的角膜緣上皮細(xì)胞，在無血清培

11、養(yǎng)和血清培養(yǎng)條件下，細(xì)胞增殖能力(A值)差異無顯著性(p>0.05)；但二組與無DMSO組比較，差異顯著(p<0.001)。在無血清培養(yǎng)組中，以3T3細(xì)胞為滋養(yǎng)層，細(xì)胞增殖能力(A值)與巨噬細(xì)胞相似(p>0.05)。在血清培養(yǎng)組，以1640培養(yǎng)基的細(xì)胞增殖能力最強，與MEM組和DMEM組比較，其A值差異顯著(p<0.05)。在相同的冷凍條件下，血清培養(yǎng)組細(xì)胞增殖能力(A值)顯著高于無血清培養(yǎng)組(p<0.05，P<0.01)。 2)

12、冷凍速率的影響：采用1℃/min的冷凍速率降溫與直接移人液氮比較，角膜緣上皮細(xì)胞在無血清培養(yǎng)和血清培養(yǎng)條件下，細(xì)胞增殖能力(A值)差異無顯著性(p>0.05)。在無血清培養(yǎng)組中，3T3細(xì)胞做滋養(yǎng)層的細(xì)胞增殖能力(A值)與巨噬細(xì)胞相似(p>0.05)。在血清培養(yǎng)組，仍以1640培養(yǎng)基的細(xì)胞增殖能力最強，與MEM組和DMEM組比較，其A值差異顯著(p<0.05)。在相同的冷凍條件下，血清培養(yǎng)組細(xì)胞增殖能力(A值)顯著高于無血清培養(yǎng)組(p<0

13、.05，P<0.01)。 3)冷凍與新鮮組織的比較：在血清培養(yǎng)條件下，兩組的細(xì)胞增殖能力差異無顯著性(p>0.05)；但在無血清培養(yǎng)基中，冷凍組織的細(xì)胞增殖能力明顯低于新鮮組織(p<0.01)。 論文三： 各組角膜緣上皮細(xì)胞核中均可見PCNA表達(dá)，染色呈棕黃色或棕褐色，染色陽性細(xì)胞主要在基底細(xì)胞層，但EGF組染色較深，中間細(xì)胞層可見較多的陽性細(xì)胞。EGF組的PCNA染色陽性率顯著高于無EGF組(p<0.01)；而

14、不同濃度的EGF組之間陽性率無顯著差異(p>0.05)。 論文四： 超低溫保存的人與兔角膜緣上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化相似。角膜緣上皮仍呈復(fù)層結(jié)構(gòu)。器官培養(yǎng)第20天，角膜緣中間層和基底層上皮細(xì)胞只見細(xì)胞輪廓，細(xì)胞問橋粒尚可見；核溶解壞死；有的細(xì)胞核內(nèi)可見凋亡小體。 結(jié) 論 1．角膜緣上皮組織適合采用超低溫冷凍法保存；其活性不受降溫速率和貯存時間的影響；因此保存方法簡便。2.角膜緣干細(xì)胞對超低溫的耐受性顯著

15、強于表層分化的上皮細(xì)胞。 3．超低溫保存的角膜緣干細(xì)胞增殖，比新鮮組織更具有血清依賴性。 4．消化培養(yǎng)法不適于冷凍角膜緣上皮細(xì)胞培養(yǎng)，組織塊培養(yǎng)法是值得推的方法。 5．在兔角膜緣上皮細(xì)胞的含血清培養(yǎng)中，RPMI一1640為優(yōu)選培養(yǎng)基。 6.在無血清培養(yǎng)中，可用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞代替3T3細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，簡化培養(yǎng)過程。 7.在器官培養(yǎng)中，EGF能上調(diào)超低溫冷凍保存的角膜緣上皮細(xì)胞PC-NA的表達(dá)；但無