芒果mangiferaindical.體細(xì)胞胚胎發(fā)生及胚性培養(yǎng)物超低溫保存的研究

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文芒果( M a n g i f e m i n d i c aL ．) 體細(xì)胞胚胎發(fā)生及胚性培養(yǎng)物超低溫保存的研究作者：吳永杰導(dǎo)師：黃學(xué)林教授專業(yè)：植物學(xué)各辯孌員會( 簽名)主席：例踢 委員2 確一’／、／，f l 氣∥鵜販喟 ；辯中山大學(xué)生命科學(xué)院中國·廣州5 1 0 2 7 52 0 0 5 年1 0 月芒果體細(xì)胞胚胎發(fā)生及胚性培養(yǎng)物超低溫保存的研究 吳永杰 中山博士大學(xué)學(xué)位論文面與培養(yǎng)基接觸的表皮細(xì)胞

2、誘導(dǎo)獲得，而珠心組織的兩側(cè)表皮細(xì)胞均可誘導(dǎo)胚性培養(yǎng)物。無論是子葉還是珠心組織為外植體，紫花芒的體胚發(fā)生能力( 2 8 ．4 和1 2 ．O ％)均高于紅芒( 1 4 ．4 和4 ．0 ％) 。對同一基因型來說，子葉的體胚發(fā)生能力高于珠心組織。連續(xù)三年的實驗表明，子葉外植體均保持了較穩(wěn)定的體胚發(fā)生能力，而珠心組織只在其中一年誘導(dǎo)獲得了體胚發(fā)生。同時誘導(dǎo)獲得的胚性培養(yǎng)物可轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基上穩(wěn)定的增殖和保存。在懸浮培養(yǎng)條件下，胚性培養(yǎng)物可快速增

3、殖并完全同步于原胚階段。組織學(xué)觀察表明胚性培養(yǎng)物細(xì)胞保持了明顯的胚性特征。增殖的胚性培養(yǎng)物在轉(zhuǎn)到體胚成熟誘導(dǎo)培養(yǎng)基上后可直接經(jīng)體胚發(fā)生形成正常的子葉胚，并進(jìn)一步萌發(fā)形成再生植株。首次報道了紫花芒和紅芒胚性培養(yǎng)物的超低溫保存技術(shù)。研究表明芒果胚性培養(yǎng)物可以采用直接干燥法或玻璃化法進(jìn)行超低溫保存。采用直接干燥法脫水處理1小時，胚性培養(yǎng)物的含水量就降至5 8 ％，在超低溫保存后的存活率為8 ．3 ％。然而進(jìn)一步延長脫水處理時間卻造成了對胚性培

4、養(yǎng)物的致命傷害。玻璃化法對芒果胚性培養(yǎng)物的脫水速率最高，保護(hù)作用也是最好的。在脫水處理1 5 分鐘后，其含水量迅速降至4 0 ％，超低溫保存后得到了9 1 ％的存活率。本實驗中材料生理狀態(tài)的調(diào)控是超低溫保存成功的另一個重要因素。處于指數(shù)生長期的胚性培養(yǎng)物在超低溫保存后的存活率均高于緩慢生長期。同時與固體培養(yǎng)的胚性培養(yǎng)物相比，由于懸浮培養(yǎng)的胚性培養(yǎng)物具有很高的同步性，組織均一性好，所以其超低溫保存后的存活率也更高。本研究表明芒果胚性培養(yǎng)物

5、超低溫保存的最佳程序為：選取處于指數(shù)生長期的快速增殖的胚性培養(yǎng)物( 懸浮培養(yǎng)) 為試材，用低溫保護(hù)劑P V S 3 ( 5 0 ％蔗糖+ 5 0 ％甘油) 脫水處理1 5 - 3 0 分鐘后，更換新鮮的低溫保護(hù)劑溶液，隨后將胚性培養(yǎng)物直接投入液氮超低溫保存。化凍后的胚性培養(yǎng)物在固體增殖培養(yǎng)基上再培養(yǎng)，約1 7天后即可觀察到新的胚性培養(yǎng)物再生，胚性培養(yǎng)物的存活率最高可達(dá)1 0 0 ％。為驗證離體和超低溫保存的安全性，對離體培養(yǎng)和超低溫保存