葡萄莖尖超低溫保存及超低溫療法脫毒研究.pdf

1、葡萄(Vitis)是世界范圍內(nèi)最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的果樹之一，城市化、工業(yè)化、土壤鹽堿化和沙漠化等原因?qū)е缕咸言S多野生種與栽培種瀕臨滅絕。建立高效、簡(jiǎn)易的種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存技術(shù)能有效地保護(hù)種質(zhì)資源的多樣性。超低溫保存是目前植物種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存最為理想的方法。病毒病是制約葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。栽培無毒苗是生產(chǎn)上防治病毒病害最為有效的措施。生產(chǎn)無毒苗是栽培無毒苗的核心技術(shù)。近年來建立的超低溫療法，為葡萄無毒苗生產(chǎn)提供了一種新技術(shù)。本研究

2、以葡萄(Vitis)試管苗為試材，建立了莖尖小滴-玻璃化法超低溫保存體系，為葡萄種植資源超低溫庫的建立提供了高效、廣譜的超低溫保存方法。建立了超低溫療法，有效的脫除了葡萄卷葉相關(guān)病毒-3(Grapevine leafroll-associated virus3，GLRaV-3)，為葡萄脫毒苗的生產(chǎn)提供了核心技術(shù)。同時(shí)，試管指示植物法、微樣直接RT-PCR、免疫組織化學(xué)定位病毒檢測(cè)為脫毒和病毒檢疫提供技術(shù)支撐。本研究主要結(jié)果如下:

3、　　1.通過優(yōu)化影響葡萄莖尖超低溫保存的關(guān)鍵因素，建立了簡(jiǎn)易、高效、光譜的葡萄莖尖小滴-玻璃化法超低溫保存體系。含5-6片葉原基的腋芽(尺寸約1.0 mm)取自8周苗齡歐洲葡萄‘赤霞珠’(Vitis vinifera‘Cabemet Sauvignon’)試管苗，在預(yù)培養(yǎng)基(0.3 M蔗糖+0.16μM還原型谷胱甘肽+0.14μM L-抗壞血酸，pH=5.7)上暗培養(yǎng)3d。加載液（2 M甘油+0.4 M蔗糖）常溫處理20 min，再用1

4、/2濃度植物玻璃化溶液(PVS2)和全濃度PVS2冰上分別處理30 min和25-50 min，然后將莖尖放置于鋁箔條上的PVS2小滴(2.5μL)中，直接投入液氮中保存。保存后的攜帶莖尖的鋁箔條迅速轉(zhuǎn)移到卸載液(1.2 M蔗糖)中常溫解凍20 min，培養(yǎng)于含0.6 M蔗糖的恢復(fù)培養(yǎng)基中恢復(fù)24 h。再將莖尖轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基中獲得再生植株。再生培養(yǎng)基含1/2 MS+0.5 mg L-1 BA+7 gL-1瓊脂，培養(yǎng)6周后可獲得正常發(fā)育

5、的植株。將該技術(shù)應(yīng)用于其他7個(gè)葡萄基因型，包括5個(gè)歐洲葡萄和2個(gè)華東葡萄(V.pseudoreticulata)，獲得50.5％的平均再生率。再生率最高的是‘赤霞珠’(71.7％)，最低的是‘白河35-1’(V.pseudoreticulata‘Baihe35-1’，21.7％)。谷胱甘肽和抗壞血酸加入預(yù)培養(yǎng)基，解決了超低溫保存后不再生的問題。比較腋芽著生部位和芽的類型對(duì)超低溫保存再生率的影響，發(fā)現(xiàn)對(duì)于葡萄，腋芽比頂芽更適合用于超低溫保

6、存。通過組織學(xué)定位觀察成活細(xì)胞的分布和數(shù)目探究PVS2處理不同時(shí)間對(duì)超低溫保存成活率和再生率的影響，揭示超低溫保存的莖尖成活模式。ISSR(inter-simple sequence repeat，內(nèi)部簡(jiǎn)單序列重復(fù))和RAPD(random amplificationof polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)技術(shù)用于檢測(cè)葡萄莖尖超低溫保存后得到的再生植株的遺傳穩(wěn)定性，未發(fā)現(xiàn)異常條帶。超低溫保存后的再生苗經(jīng)過7次繼代培

7、養(yǎng)，其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)逐漸優(yōu)于普通組培苗。
　　2.建立莖尖小滴-玻璃化法超低溫療法以脫除GLRaV-3。從6周苗齡的‘赤霞珠’試管苗上取包含1個(gè)腋芽的單莖段，每個(gè)單莖段長(zhǎng)約1.0 cm，培養(yǎng)于1/2 MS培養(yǎng)基中促進(jìn)頂芽萌發(fā)。2周后，取項(xiàng)芽(1.0 mm，含5-6片葉原基)，置于預(yù)培養(yǎng)基(0.3 M蔗糖+0.16μM還原型谷胱甘肽+0.14μM L-抗壞血酸的)上暗培養(yǎng)3d。用加載液常溫處理20 min，再用1/2 PVS2冰上處理30

8、 min，之后在PVS2中處理不同75 min。然后將莖尖轉(zhuǎn)移至鋁箔條上的PVS2小滴(2.5μL)中，直接投入液氮中。處理后的莖尖用卸載液常溫處理20 min，培養(yǎng)于恢復(fù)培養(yǎng)基中恢復(fù)24 h。再將莖尖轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)6周后可獲得正常發(fā)育的脫毒苗。超低溫療法對(duì)GLRaV-3的脫毒率為100％，莖尖大小或PVS2處理時(shí)間不影響脫毒率。利用免疫組織化學(xué)法觀察GLRaV-3在莖尖中的分布，GLRaV-3在頂端分生組織和第1-4片葉原基沒

9、有分布，在距離頂端分生組織約0.2 mm處和第5片葉原基及更老組織有分布。超低溫療法后，第5片葉原基的細(xì)胞全部死亡。超低溫療法處理后的莖尖成活細(xì)胞分布，結(jié)合病毒定位結(jié)果，解釋了超低溫療法能夠脫除GLRaV-3的原因。
　　3.優(yōu)化、建立了微樣直接RT-PCR(microtissue direct RT-PCR)法、免疫組織化學(xué)定位、試管指示植物和微嫁接四種技術(shù)對(duì)GLRaV-3進(jìn)行檢測(cè)和定位。以歐洲葡萄‘赤霞珠’為試材檢測(cè)GLRaV

10、-3時(shí)，微樣直接RT-PCR使用注射針刺穿植株葉片或莖段，將針頭剪斷，置于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物PCR管中，加蓋等待15 min，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該方法成功的應(yīng)用到超低溫療法脫除GLRaV-3的脫毒苗檢測(cè)，與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果比較，沒有差異。免疫組織化學(xué)法定位GLRaV-3在組織中的分布，并成功的應(yīng)用到葡萄莖段、莖尖組織的GLRaV-3定位，進(jìn)一步證實(shí)GLRaV-3是維管束限制性病毒，并且不能夠侵染到頂端分生組織和幼嫩的第1-4片葉原基

11、。試管指示植物法，將感染GLRaV-3的試管苗莖段（約3 cm長(zhǎng)，帶2-3片葉）培養(yǎng)在含150 mM NaCl脅迫培養(yǎng)基中，最早在5d即可觀察到典型的卷葉病癥狀:葉片紅色、葉緣向內(nèi)卷曲，培養(yǎng)4周時(shí)有86％的癥狀顯示比例。將其應(yīng)用到其他三個(gè)基因型上，150 mM NaCl在雜交砧木‘6-12-2’(V.pseudoreticulata‘Baihe-35-1’×V.vinifera‘Carinena’)上顯示癥狀最早，為4d，4周時(shí)癥狀占比