海帶種質(zhì)超低溫保存技術(shù)的研究.pdf

1、豐富的種質(zhì)資源是漁業(yè)生產(chǎn)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，保護(hù)和利用好海帶種質(zhì)資源將為提高海帶品種水平、實現(xiàn)海帶良種化生產(chǎn)提供重要保證，使我國這一具有傳統(tǒng)優(yōu)勢的重要產(chǎn)業(yè)在新世紀(jì)仍然保持世界領(lǐng)先水平。低溫生物學(xué)是探索低溫條件下生命現(xiàn)象的特征和規(guī)律，以及保存生物體、細(xì)胞的一門科學(xué)。生物細(xì)胞、組織、器官、胚胎甚至個體在超低溫(—196℃)狀態(tài)下代謝完全停止，生命以靜止的形式可以在這種狀態(tài)下長期保存，解凍后又可恢復(fù)其原有的生物活性和遺傳特性。將超低溫保存技術(shù)成功

2、應(yīng)用于海帶種質(zhì)保存將有效解決藻類種質(zhì)保存中污染、混雜、變異的問題，可望實現(xiàn)藻類種質(zhì)的永久保存。
　　 利用海帶孢子與配子體為試驗材料進(jìn)行超低溫冷凍保存技術(shù)研究，主要取得了以下研究成果：
　　 在海帶游(胚)孢子超低溫保存技術(shù)方面，降溫速率較快的兩步法可以成功凍存孢子，DMSO是對孢子毒性最小且對凍存最有效的抗凍保護(hù)劑。采用5％DMSO平衡50 min以內(nèi)，10％DMSO或甘油平衡15分鐘以內(nèi)，獲得了70％以上的配子體發(fā)生

3、率。液氮相中預(yù)凍后投液氮的簡單方法獲得了50％存活率。降溫速率較快的方法適合孢子的冷凍保存，尤其是液面上方預(yù)凍后投液氮的方法可以獲得更高的存活率。復(fù)蘇后存活的孢子能萌發(fā)成配子體，配子體可無性繁殖，也可發(fā)育為孢子體，具有完全的再生能力。凍存孢子復(fù)蘇后，存活孢子形成的雄配子體比例約60％，顯著超過雌配子體40％的比例。超低溫冷凍顯著影響了復(fù)蘇孢子發(fā)育為配子體的性別比例(one—wayANOVA，F(xiàn)=15.441，p＜0.001)。
　

4、　 在海帶配子體超低溫保存技術(shù)方面，降溫速率較慢的兩步法可成功凍存配子體克隆，獲得了70％以上的存活率。降溫速率、預(yù)凍溫度及預(yù)凍時間對凍存復(fù)蘇后配子體的存活率均有顯著影響(p＜0.01)，方差貢獻(xiàn)率量級依次為預(yù)凍溫度、預(yù)凍時間、降溫速率、降溫速率×預(yù)凍溫度、預(yù)凍溫度×預(yù)凍時間。在改善細(xì)胞抗凍性方面，預(yù)培養(yǎng)條件及性別的主效顯著；雄系較雌系具有較強(qiáng)的抗凍性。經(jīng)過凍存的海帶無性繁殖系可以繼續(xù)無性繁殖，也可發(fā)育為孢子體，具有完全的再生能力。<

5、br>　　 在海帶配子體克隆的膠囊化脫水法保存技術(shù)方面，脫水率和脫水速率綜合影響著凍存存活率，當(dāng)含水量超過70％或低于20％，導(dǎo)致所有細(xì)胞的死亡。在膠球20％—70％含水量之間，三種脫水方法的配子體復(fù)蘇存活率差異顯著。其中采用低溫冷藏柜陰干的干燥方法獲得了較高的平均存活率。采用陰干法將膠球含水量降低到40％時獲得了最高的存活率(one—way ANOVA，p＜0.01)．在—40℃或—60℃下預(yù)凍30—60min獲得了較高的存活率(o