馬鈴薯莖尖超低溫保存耐性細胞學基礎的研究.pdf

1、馬鈴薯是世界上重要的糧食作物之一，種質(zhì)資源的安全保存是馬鈴薯種質(zhì)利用、新基因挖掘、優(yōu)異品種育種等產(chǎn)業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎。已采用多種保存形式進行馬鈴薯種質(zhì)的保存，如田間圃位保存、試管苗保存、超低溫保存等。超低溫保存是無性繁殖作物種質(zhì)長期安全保存的重要方法，研發(fā)優(yōu)化的玻璃化等超低溫保存技術(shù)已用于馬鈴薯超低溫保存，但超低溫保存機理研究較少。本研究以馬鈴薯品種“呼自81-213”、“Q504”和“克新4號”試管苗莖尖為試驗材料，采用小滴玻璃化法超低

2、溫保存，通過對關(guān)鍵步驟莖尖恢復培養(yǎng)，分析超低溫保存關(guān)鍵步驟對莖尖成活率的影響；利用優(yōu)化的2，3，5-三苯基四氮唑（TTC）染色條件對莖尖進行活力染色，觀察關(guān)鍵步驟的莖尖細胞存活模式；采用差示掃描量熱分析和超低溫電鏡掃描觀察技術(shù)探討超低溫關(guān)鍵步驟馬鈴薯莖尖細胞水分變化。以期從超低溫保存關(guān)鍵步驟莖尖細胞的存活模式和水分變化角度揭示莖尖細胞的損傷和存活機理，主要研究結(jié)果如下：
　　1.新鮮莖尖和蔗糖預培養(yǎng)后莖尖直接恢復培養(yǎng)成活率為100

3、％，PVS2處理30 min和60 min后莖尖成活率下降。液氮保存后，莖尖經(jīng)恢復培養(yǎng)后成活率繼續(xù)降低，且PVS2處理30 min的莖尖成活率低于PVS2處理60 min的莖尖成活率。
　　2.馬鈴薯莖尖TTC活力染色條件的優(yōu)化結(jié)果表明，40℃下染色2 h為最佳染色條件。利用優(yōu)化的TTC活力染色條件，對3個馬鈴薯品種小滴玻璃化超低溫保存關(guān)鍵步驟處理的莖尖進行TTC活力觀察。研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)蔗糖預培養(yǎng)（MS培養(yǎng)液添加0.3 mol/L和

4、0.5 mol/L蔗糖）的莖尖與新鮮莖尖均保持較高活力；經(jīng)PVS2處理后莖尖表現(xiàn)時空特異性活力喪失和存活，分生組織和葉原基中間區(qū)域仍保持較高活力。通過對莖尖TTC活力染色面積測定，發(fā)現(xiàn)當莖尖TTC活力染色面積比≥0.4時，TTC活力染色與恢復培養(yǎng)存活率呈現(xiàn)極顯著相關(guān)(P<0.01)。且面積比≥0.45時的染色率更接近莖尖成活率。
　　3.馬鈴薯莖尖熱力學分析和超低溫掃描電鏡觀察結(jié)果表明，與新鮮莖尖相比，蔗糖預培養(yǎng)和PVS2保護劑處