巴西橡膠樹HbWRKY1轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、WRKY是近年來發(fā)現(xiàn)的一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族,參與植物的抗逆脅迫和衰老等生理生化過程,病原菌侵染、機械傷害和植物激素類物質(zhì)刺激(如乙烯利、茉莉酸、水楊酸)等均能誘導(dǎo)WRKY基因的表達。巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)是天然橡膠的主要來源?？寺∠鹉z樹WRKY基因,研究其在橡膠樹中潛在的生物學(xué)功能,對深入了解橡膠樹抗逆以及與割膠傷害有關(guān)分子特征,具有重要的意義。
　　 獲得研究結(jié)果:
　　 1、通過篩選已

2、構(gòu)建的乙烯利刺激條件下巴西橡膠樹膠乳與未處理膠乳差異表達的cDNA消減文庫,我們獲得了一個與WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有較高同源性的EST序列HbEST125;結(jié)合RACE和RT-PCR技術(shù),從巴西橡膠樹中首次克隆了一個編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因,命名為libWRKYI(GenBank登錄號:GU372969)。
　　 2、生物信息學(xué)分析表明,該基因全長cDNA含有1234個核苷酸,包含一個912 bp的完整開放閱讀框序列(ORF),編

3、碼一個含有303個氨基酸殘基的多肽。推導(dǎo)氨基酸序列含有一個與其它植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子一致的WRKY高度保守的氨基酸序列,在其C端還有一個由兩個半胱氨酸和兩個組氨酸組成的鋅指結(jié)構(gòu),由此可以判定HbWRKY1屬于WRKY家族中的第Ⅱ類;推導(dǎo)氨基酸序列與蓖麻(Ricinus communis,EEF47235)、白楊(Populus tremula x Populus alba.ABK41486)和大豆(Glycine max,ABC2692

4、0)相應(yīng)的WRKY同源性分別高達79％、73％和58％。
　　 3、利用Genome Walking技術(shù),從巴西橡膠樹葉片基因組DNA中克隆得到HbWRKY1基因1377 bp的5'端調(diào)控序列(GenBank登錄號:GU372970)。序列分析顯示,該片段除了含有一個典型的核心啟動子區(qū)域外,還含有多個TATA-box、CAAT-box等啟動子元件以及多種與激素和脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的順式調(diào)控元件,這暗示HbWRKY1轉(zhuǎn)錄因子可能參與了橡

5、膠樹逆脅迫、激素響應(yīng)的調(diào)控。
　　 4、利用半定量RT-PCR技術(shù)研究了HbWRKY1的表達特征。結(jié)果顯示,HbWRKY1在巴西橡膠樹中里組成型表達,但具有明顯的組織差異性,其在膠乳中大量表達,花中次之,樹皮、根和樹葉中少量表達;ET、JA和機械傷害能夠誘導(dǎo)HbWRKY1在膠乳中的表達;干旱、ABA和白粉病侵染明顯誘導(dǎo)HbWRKY1在葉片中的表達。
　　 5、成功構(gòu)建了HbWRKY1過量表達的植物表達載體pCAMBIA1

6、304-HbWRKY1,通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法獲得了65株轉(zhuǎn)基因煙草。干旱脅迫試驗證實,HbWRKY1的過量表達可以明顯提高轉(zhuǎn)基因煙草對干旱脅迫的耐受能力,但機械傷害、高溫脅迫等對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株的影響差異不明顯。
　　 結(jié)論:HbWRKY1在巴西橡膠樹中呈組成型表達,但具有明顯的組織差異性,其在膠乳中大量表達,花中次之,樹皮、根和樹葉中少量表達:ET、JA和機械傷害能夠誘導(dǎo)HbWRKY1在膠乳中的表達;干旱、ABA