人SCL基因重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、目的： 構(gòu)建含人SCL基因的pDC315-SCL重組腺病毒載體, 為下一步研究SCL基因在ICC樣細(xì)胞的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 方法： 從含有人SCL基因的質(zhì)粒中，采用PCR方法擴(kuò)增SCL基因，將目的載體pDC315-EGFP進(jìn)行酶切后交換，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)克隆產(chǎn)物進(jìn)行菌落PCR鑒定，對(duì)陽(yáng)性克隆產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，比對(duì)正確的克隆即為構(gòu)建成功的重組穿梭質(zhì)粒。pDC315-EGFP/SCL,在脂質(zhì)體介導(dǎo)下與腺病毒輔助大

2、質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝產(chǎn)生復(fù)制缺陷型重組腺病毒pDC315-SCL經(jīng)HEK293細(xì)胞擴(kuò)增，純化后測(cè)定病毒滴度。通過(guò)觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)評(píng)估重組腺病毒對(duì)Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率。
　　 結(jié)果： PCR擴(kuò)增的SCL基因片段長(zhǎng)度為1036bp，測(cè)序結(jié)果以及重組質(zhì)粒pDC315-EGFP-SCL陽(yáng)性克隆凝膠電泳鑒定均證明SCL基因成功克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒真核表達(dá)載體中。pDC315-S

3、CL重組腺病毒載體通過(guò)PCR結(jié)果證明和Western Blot檢測(cè)證實(shí)pDC315-SCL重組腺病毒載體構(gòu)建成功，滴度達(dá)到1×1010PFU/mL，對(duì)膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率可達(dá)95%。
　　 結(jié)論： 成功構(gòu)建了含人SCL基因真核表達(dá)載體pDC315-EGFP-SCL和應(yīng)用AdMax載體系統(tǒng)成功構(gòu)建含人SCL基因重組腺病毒載體pDC315-SCL。pDC315-SCL重組腺病毒載體對(duì)Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞有很高的轉(zhuǎn)染效率。