人IFN-β基因復(fù)制缺陷型腺病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、干擾素是第一個(gè)被用于臨床治療人類腫瘤的細(xì)胞因子，在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中其抗增生和免疫調(diào)節(jié)作用是毋庸置疑的。在針對(duì)多種腫瘤的研究中，Ⅰ型干擾素尤其是IFNβ的抗腫瘤增殖作用更為明顯.國(guó)內(nèi)外的基礎(chǔ)研究正從分子水平試圖揭示其復(fù)雜的直接作用或協(xié)同調(diào)節(jié)的機(jī)制，但是，更多的目光還是投向了對(duì)其生物學(xué)作用的利用上。生理?xiàng)l件下，許多體內(nèi)的細(xì)胞因子低度表達(dá)，由于機(jī)體的自穩(wěn)系統(tǒng)而受到嚴(yán)格的分泌調(diào)控，并且這些細(xì)胞因子的半衰期極短，蛋白清除率較高，所以血藥濃度很低，

2、IFNβ也不例外；但是治療作用的IFNβ血藥濃度較高，如果人為的靜脈給藥使血藥濃度增高到最大耐受劑量，由于以上原因，血藥濃度水平不僅不能維持穩(wěn)定，而且會(huì)導(dǎo)致極大的系統(tǒng)毒副作用，無法達(dá)到抗增生作用。提高局部藥物濃度能夠解決這一問題。 腺病毒載體是一個(gè)相對(duì)成熟的病毒載體，國(guó)外早已用腺病毒載體開展了Ⅲ期臨床試驗(yàn)，并在單基因遺傳性疾病和某些腫瘤的治療中凸顯療效。早期的腺病毒載體存在著較強(qiáng)的免疫原性，且由于腺病毒呈一過性表達(dá)，需要反復(fù)使用

3、，存在發(fā)生嚴(yán)重免疫反應(yīng)的可能性；另外包裝過程中復(fù)制型病毒的產(chǎn)生也給臨床應(yīng)用帶來風(fēng)險(xiǎn)。但現(xiàn)在腺病毒構(gòu)建的方法和載體本身已經(jīng)被多次優(yōu)化，和其他載體比較，其優(yōu)點(diǎn)已超過其局限性。 在我國(guó)處于腫瘤發(fā)病率逐年增高的形勢(shì)下，我們希望通過構(gòu)建IFNβ的腺病毒載體，結(jié)合前期對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的研究，找到一個(gè)合適的、能夠富集于腫瘤局部發(fā)揮IFNβ生物學(xué)作用的腫瘤疫苗，為促進(jìn)其早日成為安全高效的腫瘤治療藥物奠定基礎(chǔ)。 材料與方法 1從健

4、康人外周血中提取出基因組DNA，以此為模版，用pyrobestTaq酶PCR法擴(kuò)增出hIFNβ基因片段。將目的基因克隆入中間載體pMD-18T載體，經(jīng)藍(lán)白篩選和PCR篩選后測(cè)序，證實(shí)序列無誤； 2酶切出目的基因并將之克隆入穿梭載體pAdTrack-CMV中，將新形成的pAdTrack-CMV-hIFNβ用限制性內(nèi)切酶PmeⅠ線性化，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)染大腸桿菌株BJ5183細(xì)胞中?？敲顾丶懊盖泻Y選出重組子p

5、Ad-hIFNβ； 3內(nèi)切酶pacⅠ再次將重組子線性化，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞株HEK293。借助GFP的表達(dá)可以跟蹤觀察包裝病毒Ad-hIFNβ的產(chǎn)生。重組腺病毒載體感染293細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，經(jīng)過四次擴(kuò)增，純化后，用空斑形成實(shí)驗(yàn)法測(cè)定病毒滴度；4RT-PCR法證實(shí)hIFNβ基因. 結(jié)果 各中間載體經(jīng)PCR法，限制性酶切分析，DNA測(cè)序證實(shí)正確。轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中2-3天產(chǎn)生病毒，7-10天出現(xiàn)病毒斑。最終的包裝病毒中