攜帶白蛋白啟動子和IDO基因的重組腺病毒載體的構(gòu)建.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、[目的]構(gòu)建攜帶小鼠白蛋白啟動子和IDO基因的重組腺病毒載體，研究其在肝臟Hepa1-6細胞的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達情況。 [方法]按照引物設(shè)計的基本原則設(shè)計白蛋白啟動子引物，人工合成白蛋白啟動子，亞克隆至沒有啟動子的腺病毒穿梭載體pAdTrack的XbaI/HindIII酶切位點，構(gòu)建攜帶有小鼠白蛋白啟動子的pAdTrack-PmALB載體；酶切含有小鼠全長IDOcDNA的PCOUS-2質(zhì)粒，亞克隆至穿梭載體pAdTrack-Pm

2、ALB、pAdTrack-CMV上的XhoI/EcoRV酶切位點，在BJ5183細菌中和AdEasy-1進行同源重組，生成并篩選含有目的基因的腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-CMV/mIDO和pAdEasy-malb/mIDO的陽性克隆，酶切、測序鑒定正確后，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染AD-293細胞進行包裝，擴增，檢測病毒滴度，RT-PCR和熒光顯微鏡鑒定和檢測重組腺病毒轉(zhuǎn)染AD-293細胞后IDO的表達。將含有目的基因mIDO的病毒轉(zhuǎn)染Hepa1-

3、6細胞，RT-PCR和WesternBlot法分別檢測Hepa1-6細胞中mIDO基因和蛋白表達。 [結(jié)果]經(jīng)酶切及測序證實攜帶白蛋白啟動子和IDO基因重組腺病毒載體構(gòu)建成功，RT-PCR檢測到轉(zhuǎn)染后AD-293細胞內(nèi)IDO的表達，病毒感染滴度為2.9×106pfu/ml，并且能夠感染Hepa1-6細胞，RT-PCR和WesternBlot可以檢測到IDO在Hepa1-6細胞內(nèi)表達。 [結(jié)論]成功構(gòu)建了攜帶白蛋白啟動子和

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