應(yīng)用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建攜帶人骨形成蛋白2基因的重組腺病毒.pdf

1、目的：利用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建攜帶hBMP2基因的重組腺病毒載體，應(yīng)用于hBMP2基因治療和在骨組織工程中對(duì)種子細(xì)胞進(jìn)行基因改造，促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。 方法：常規(guī)CaCl2法制備E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)菌，pcDNA3-hBMP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)菌。維特潔DNA小量純化試劑盒抽提pcDNA3-hBMP2質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、KpnⅠ酶切，酶切產(chǎn)物通過(guò)1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，

2、1.0％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與理論上pcDNA3-hBMP2質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)圖譜吻合；將pcDNA3-hBMP2送交上海申友公司進(jìn)行雙向測(cè)序，hBMP2基因序列與已報(bào)告的hBMP2基因序列吻合。pAdTrack-CMV腺病毒穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)菌，維特潔DNA小量純化試劑盒抽提pAdTrack-CMV質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、KpnⅠ、PacⅠ酶切，酶切產(chǎn)物通過(guò)1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，1.0％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與理

3、論上pAdTrack-CMV質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)圖譜吻合。pcDNA3-hBMP2質(zhì)粒和腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV經(jīng)KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切，凝膠回收試劑盒回收hBMP2基因片斷和pAdtrack-CMV載體片斷，回收的載體片斷和目的基因片斷T4DNALigase進(jìn)行酶連反應(yīng)。酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)菌，維特潔DNA小量純化試劑盒抽提重組pAdtrackCMV-hBMP2穿梭質(zhì)粒，PmeⅠ、PacⅠ、BamHⅠ酶切

4、，酶切產(chǎn)物通過(guò)1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果與pAdTrackCMV-hBMP2質(zhì)粒預(yù)期理論酶切位點(diǎn)相吻合，證明獲得正確的重組pdTrackCMV-hBMP2質(zhì)粒。參照GenePulserXcellTMInstructionManual(電轉(zhuǎn)儀操作手冊(cè))制備EcoliBJ5183電感受態(tài)細(xì)菌，pAdEasey-1質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化E.coliBJ5183電感受態(tài)細(xì)菌，維特潔DNA小量純化試劑盒抽提pAdEasey-1質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶PacⅠ、

5、BamHⅠ酶切，酶切產(chǎn)物通過(guò)0.7％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，0.7％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與理論上pAdEasey-1質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)圖譜吻合。證明獲得正確的pAdEasey-1質(zhì)粒。將包含有pAdEasey-1質(zhì)粒的E.coliBJ5183菌命名為AdEasier-1菌。參照GenePulserXcellTMInstructionManual(電轉(zhuǎn)儀操作手冊(cè))制備AdEasier-1電感受態(tài)細(xì)菌。限制性內(nèi)切酶PmeI線性化pAdTrackCMV

6、-hBMP2穿梭質(zhì)粒，凝膠回收試劑盒回收線性化pAdTrackCMV-hBMP2穿梭質(zhì)粒，不需純化直接電轉(zhuǎn)化AdEasier-1電感受態(tài)細(xì)菌，利用E.coliBJ5183內(nèi)Cre重組酶高效的同源重組系統(tǒng)，在細(xì)菌中pAdTrackCMV-hBMP2和pAdEasy-1同源重組獲得重組腺病毒載體基因組的質(zhì)粒，維特潔DNA小量純化試劑盒抽提同源重組質(zhì)粒，0.7％瓊脂糖凝膠電泳，選擇比pAdEasy-1大的重組腺病毒質(zhì)粒，BamHⅠ、PacⅠ酶

7、切，酶切產(chǎn)物通過(guò)0.7％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，0.7％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與理論上同源重組質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)圖譜吻合。將正確的重組腺病毒質(zhì)粒命名為pAd-hBMP2。pAd-hBMP2質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化E.coliDH5α電感受態(tài)菌，大量抽提質(zhì)粒備用。pAd-hBMP2質(zhì)粒用PacⅠ線性化暴露反向的末端重復(fù)序列，采用梭華-SofastTM轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞(293Ecells)，轉(zhuǎn)染條件為細(xì)胞密度約為50％，質(zhì)粒量為4ug/35mm培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)染試劑量20ul