同源重組與Gibson Assembly方法構(gòu)建腺病毒載體對比.pdf

1、目的：腺病毒廣泛存在于自然中，能通過呼吸道、消化道、眼粘膜等途徑感染動物和人，無論增殖和非增殖細(xì)胞也都可以被感染，對人類的致病性低，且與人類基因組同源，不會整合到人染色體中，不會導(dǎo)致染色體突變。如果用腺病毒作為特異性DNA序列呈遞載體，將具有感染效率高、安全性好、多種給藥途徑、成本易控制、便于保存等優(yōu)勢。本研究用傳統(tǒng)同源重組與近年來開發(fā)的Gibson Assembly及兩者相結(jié)合三種構(gòu)建腺病毒載體的方法進(jìn)行構(gòu)思、設(shè)計(jì)、制作和對比，并做出

2、評價，為腺病毒載體構(gòu)建提供依據(jù)和經(jīng)驗(yàn)。
　　方法:將E1區(qū)、E3區(qū)、蛋白IX缺損的AD4（4型腺病毒）感染入Hela229細(xì)胞，使其在細(xì)胞中感染、增殖72小時，并用超濾管提取AD4 DNA。分為三組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：第一組用同源重組方法，經(jīng)PCR將pBR322質(zhì)粒中擴(kuò)增左右兩條同源臂，同源臂與AD4 DNA兩端同源，將AD4 DNA鑲嵌入pBR322質(zhì)粒，構(gòu)建出攜帶全長AD4 DNA的腺病毒載體。第二組用Gibson Assembly方法

3、，將AD4 DNA分成4段（每段10kbp左右）和pBR322質(zhì)粒，共5段DNA，兩側(cè)均設(shè)計(jì)30bp左右同源臂，用PCR分別擴(kuò)增，再用Gibson Assembly方法將數(shù)段基因連接起來。第三組用Gibson Assembly和同源重組相結(jié)合方法，將DY330中含有kil和Red基因的一段基因組及第一組中的pBR322質(zhì)粒及左右兩條同源臂，共4段DNA，分別用PCR分別擴(kuò)增，用Gibson Assembly方法將4段DNA連接，再與全長

4、AD4 DNA進(jìn)行同源重組。三組方法構(gòu)建的腺病毒載體進(jìn)行測序等鑒定，比較三種方法構(gòu)建腺病毒載體的效價。
　　結(jié)果：經(jīng)鑒定，用同源重組方法構(gòu)建腺病毒載體：培養(yǎng)平板中菌落數(shù)量大于1000個，對其中360個鑒定，陽性結(jié)果有1個。用Gibson Assembly方法構(gòu)建腺病毒載體：培養(yǎng)平板中菌落數(shù)量有112個，對其中10個鑒定，陽性結(jié)果有3個。用Gibson Assembly和同源重組相結(jié)合方法構(gòu)建腺病毒載體：培養(yǎng)平板中菌落數(shù)量有65個，