人CYP2D6的基因多態(tài)性及與藥物代謝關(guān)系的研究.pdf

1、藥物代謝主要在肝臟，依賴于肝微粒體中的多種酶系，最重要的是細(xì)胞色素P450混合功能氧化酶。CYP450的基因多態(tài)性是造成藥物不良反應(yīng)的主要原因。孫忠實(shí)教授報(bào)道藥物不良反應(yīng)造成的死亡率日益升高。 在過(guò)去的幾十年里，藥物研發(fā)中對(duì)化合物代謝性質(zhì)的篩選放在臨床前研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究階段。這種藥物研發(fā)模式存在著很大的缺陷，不同的種屬動(dòng)物與人之間存在著很大的差異，尤其是在代謝方面，參與化合物代謝的酶種類、酶的貢獻(xiàn)程度、反應(yīng)類型以及代謝產(chǎn)物等均

2、可能不相同，把動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推到人體誤差高且準(zhǔn)確性低，同時(shí)，通量低、價(jià)格成本高。隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)的發(fā)展，使藥物研發(fā)的上游基礎(chǔ)技術(shù)有了極大的突破．采用人源組織或人源酶的體外實(shí)驗(yàn)，花費(fèi)少、周期短、能提供大量的信息，最重要的是還能去除種屬差異的影響。本文將CYP450酶建立起體外篩選體系，進(jìn)行體外代謝數(shù)據(jù)和性質(zhì)到體內(nèi)代謝數(shù)據(jù)和性質(zhì)的預(yù)測(cè)，具有了高通量、高效率、高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)。 具體方法是以市售CYP2D

3、6 WT的cDNA作為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，構(gòu)建pYES2/CT-WT重組質(zhì)粒；然后利用PCR定點(diǎn)突變的方法分別引入8個(gè)單點(diǎn)突變位點(diǎn)；測(cè)序確定序列完全正確后，將質(zhì)粒以電穿孔法轉(zhuǎn)化至整合了POR基因的釀酒酵母菌株BJ5628，半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)CYP2D6蛋白，經(jīng)裂解、差速離心提取CYP2D6微粒體后，連續(xù)光譜熒光儀上用CYP2D6的特異底物AMMC測(cè)定酶的活性，得到酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vman，并用非線性回歸做圖；然后選用12種臨床常用藥做藥

4、物抑制實(shí)驗(yàn)，測(cè)定IC50。 結(jié)果顯示全序列測(cè)序證明正確獲得了8株單點(diǎn)突變的DNA(R28C，P34S，L91M，R173C，R201H，H324P,E410K,R440H)，Western-blotting用針對(duì)重組酶C端的V5免疫標(biāo)記的特異抗體證明了CYP2D6蛋白的表達(dá)成功。熒光檢測(cè)法的活性檢測(cè)結(jié)果表明不同的SNP的活性不同，其Km，Vmax，及Vmax/Km的值均有差異。其中H324P，R440H完全沒(méi)有活性；P34S的活